口蹄疫通用型实时荧光RT-PCR检测方法的建立

【摘要】：目的:本研究旨在运用先进的分子生物学手段,应用日益成熟的实时荧光定量PCR技术建立一个能快速、灵敏、准确检测家畜及其产品中口蹄疫病毒的检测技术平台,达到提高检测灵敏度,降低检测成本,缩短检验周期的目的。方法:根据GenBank数据库中已有的口蹄疫病毒5'端UTR区的IRES片段核苷酸序列,设计口蹄疫病毒引物和Taqman核苷酸探针;按说明书制备定量用标准品;建立荧光RT-PCR的检测方法;进行特异性、灵敏度和重复性实验。结果:该方法对口蹄疫病毒的检测有高度的特异性,O型、A型、C型和AsiaⅠ型均呈阳性反映,而水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒等其他动物病毒均呈阴性反映;将已知拷贝数的体外转录RNA 10倍系列稀释成2.0×10~1～2.0×10~6 6个稀释度,作为标准品,进行口蹄疫荧光RT-PCR扩增,测定其灵敏度。结果证实荧光定量RT-PCR至少可以检测到20个拷贝的口蹄疫病毒;利用3份不同CT值的阳性样品分别由两名操作员进行5次重复检测,结果其CT值变异系数均少于1.5%。以上统计表明本研究所建立的口蹄疫通用型实时荧光RT-PCR检测方法重复性好,可对口蹄疫通用型病毒进行稳定、可靠的检测。结论:该方法对口蹄疫病毒各亚型(包括O型、A型、C型和AsiaⅠ型)的检测有高度的特异性,灵敏度检测表明至少可以检测到20个拷贝病毒核酸,可对低病毒含量的样品进行准确检测,且荧光RT-PCR方法检测所需的病料少,对病料的采集方法、保存及运输等要求不高,对于因保存不当失活的病毒仍可得到客观可靠的结果。另外荧光RT-PCR方法所需时间短,传统方法检测口蹄疫病毒需几天甚至几周,而荧光RT-PCR方法从核酸抽提到反应完毕只需要4 h。因此该方法是一种检测口蹄疫病毒的良好方法,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。