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间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立

张舍郁  程安春  汪铭书  沈婵娟  李传峰  
【摘要】:建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒(DSHDV)的方法,为 DSHDV 感染的实验室诊断、DSHDV 在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。用差速离心纯化 DSHDV,将纯化 DSHDV 免疫家兔制备兔抗 DSHDV 高免血清,并以 DEAE-SephadexA-50 柱层析纯化出兔抗 DSHDV IgG,建立 IFA 检测石蜡切片中 DSHDV 的方法;利用建立的 IFA 对28 日龄鸭人工感染 DSHDV 死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测.应用 PAGE 电泳分析 DSHDV 基因组特性。IFA 最佳条件为:切片在0.01mol·L~(-1)柠檬酸(pH6.0)缓冲液微波修复20min 后,以10% 马血清37℃下封闭30min,然后加入1:50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1:100 FITC 标记的含0.01% 伊文斯蓝的二抗37℃孵育30min.IFA 检测 DSHDV 感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆茵感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性.IFA 检测28 日龄人工感染 DSHDV 死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰,肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆.经甲醛固定保持1~6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏, IFA 检测结果也呈阳性.DSHDV 具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段棱酸,呈"334"分布.建立的检测石蜡组织切片中 DSHDV 抗原的 IFA 具有直观、特异性强的优点,应用于 DSHDV 在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于 DSHDV 感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究.DSHDV 抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是 DSHDV 侵害的主要靶器官.

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