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PCV2的分离鉴定及其ORF2基因的克隆、测序与表达

王江辉  陈陆  刘红英  杨霞  任向阳  张昶  刘秋燕  王川庆  
【摘要】:对河南省10个地市的64个规模化猪场进行了猪2型圆环病毒临床发病情况调查,用ELISA对1595份血清进行了抗体检测,并用鉴别PCR对166份临诊病料进行了PCV2DNA的检测。结果显示,64个猪场有49个猪场表现为断奶后多系统衰竭综合征(PMWS),9个猪场表现为皮炎与肾病综合征(PDNS),6个猪场表现为猪呼吸道疾病综合征(PRDC);2005年抗体阳性率为24.1%(157/651),2006年为63.1%(595/944);2005年PCR检测阳性率为78%(62/81),2006年为96%(81/85)。利用鉴别PCV1和PCV2的复合PCR对PK-15细胞及阳性病料进行检测,利用3份单一PCV2阳性病料接种无PCV的PK-15细胞进行培养,盲传8代后,成功分离到3株PCV2流行毒株,分别命名为JZ、ZMD和KF株。利用PCR技术从分离的PCV2KF株中扩增出ORF2基因(702bp),并进行克隆、测序分析。遗传进化分析表明PCV-2的ORF2较保守,不同地域分离株的ORF2核苷酸同源性为92.5%-99.0%,氨基酸同源性为89.4%-94.7%;ZMD株与美洲株核苷酸同源性高达97.0%,与欧洲株仅为91.6%;KF、JZ株与欧洲株核苷酸同源性高达97.9%以上,与美洲株仅为92.0%;中国分离株之间ORF2变异较大,其亲缘关系较复杂,ZMD株与BF株核苷酸同源性最高,但JZ.KF株与BF株氨基酸同源性较高。尽管ORF2基因型较稳定,但是中国不同的地域株之间有变异,这种变异可能对PCV的诊断和研究有重要意义。对KF、JZ、ZMD株ORF2的抗原表位进行了分析。将KF株ORF2基因593bp的片段克隆到融合表达载体pET-32a中进行IPTG诱导表达,所得产物经Western-blotting可被阳性血清所识别。可利用该重组蛋白作为抗原,制备单克隆抗体或建立间接ELISA方法,为PCV2的临床诊断提供技术保障。

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