大豆胰蛋白酶抑制因子KTI单克隆抗体的制备

【摘要】：大豆胰蛋白酶抑制因子是大豆中主要的抗营养因子,生大豆中的蛋白酶抑制因子主要分KTI(Kunitztrypsin inhibitor)和BBI(Bowman-Birk Chymotrypsin Inhibitor)两大类,含量大约为30mg/g,其中KTI起主要抗营养作用。目前其检测方法有酶化学法、免疫学法,相比较而言后者方便简单,准确性高,检测量大。但检测用的单克隆抗体价格较贵,是检测的限制因素。本实验采用经三次KTI抗原免疫的成年BALB/C小鼠的脾细胞和特异系骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用聚乙二醇(PEG)介导。甲基纤维素的半固体培养基培养。ELISA检测阳性,并用染色体数和DNA含量鉴定融合结果。阳性株进行小鼠的体内诱生扩增。腹水采用辛酸-饱和硫酸铵方法纯化,SDS-PAGE测定分子量,ELISA方法测定抗原抗体的亲和常数。实验结果:经过8次融合实验,共选择出4株能稳定分泌抗体的单克隆细胞株G2、B3、G4、F5,其中阳性最强为G_4,酶标仪检测OD值最高时为1.67,效价1∶10~5。染色体检测,平均数为96条。DNA含量也表明四株皆为杂交株,且G_4含量最大。纯化结果腹水中蛋白含量0.9mg/ml,分子量为164000dalton,亲和常数达到10~8l/mol,抗体亚型为IgG1.结果表明,此KTI抗体可以作为免疫检测用。