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饲料中杂色曲霉毒素的测定方法研究

胡伟莲  叶均安  刘建新  
【摘要】:杂色曲霉毒素是一种具有强烈致癌性和急性毒性的真菌毒素,广泛存在于各类粮食和饲料中,对人类和动物具有极大的毒性和致癌性。目前检测杂色曲霉素ST的方法主要有薄层层析法(TLC),高效液相色谱法(HPLC),酶联反应法(ELISA),但目前我国尚无饲料中杂色曲霉素的检测标准。杂色曲霉毒素的测定步骤主要为样品的提取纯化和检测,包括样品采集、调制,去脂脱蛋白进行提取、纯化,紫外线照射检测荧光强度,结果确证等。本试验用TLC法对饲料中的杂色曲霉素测定进行了探索,对两种提取方法(国标法,GB/T 5009.25-1996与乙腈法)进行了比较研究,发现两种方法都简单可行,灵敏度高(20ug/kg)。但相比之下,乙腈法更简单易行,因而对其测定方法予以介绍。称取20.00g过20目筛孔的样品,置于250mL具塞锥形瓶中,加入80mL乙腈—氯化钾(90+10)溶液,振荡30min,过滤。收集样品液40mL,移入250mL分液漏斗中,再加入20mL正己烷,振摇,静置分层。当底层清晰时,弃去上层正己烷,再用20mL正己烷重复提取一次,弃去正己烷层,在乙腈—水层中加入10mL和20mL氯仿,振摇。在上层清晰时,收集底层氯仿于蒸发皿,上层再用10mL氯仿提取一次,合并氯仿,将蒸发皿放置于65℃水浴上挥干,然后再在冰浴上放置2~3min,加1.0min苯将残留物充分混匀,置入小试管中,供色谱测定,此1mL样液相当于10g样品。在薄层板上用微量注射器取一个1uL,二个ISPAN5uL,一个10uL的样品液,和1uL、2uL、5uL、10uL标准杂色曲霉素(20ug/kg)的点(20ug/kg为此方法的最低检出量)。在一个5ul样品液的点上,再重叠点5uL标准杂色曲霉素作为标准。在展开槽内用苯、乙酸、甲醇(90+5+5)展开薄层板,保持槽内溶剂的平衡,展至9cm左右,取出通风挥干。以氯化铝溶液均匀喷板,用80℃的温度加热10分,在紫外光(365nm)下检查薄层板,可看到嫩黄色杂色曲霉毒素标准的荧光点。观察样品展开线同—Rf处是否有同样黄色荧光点,若没有,说明样品中杂色曲霉毒素在20ug/kg以下。若有,则与标准点的荧光强度比较,找出与样品荧光强度相当的标准点。如果最弱的样品点还比最强的标准点荧光强,则需要稀释样品液,重新进行薄层色谱,然后按以下的公式,计算出样品中杂色曲霉毒素含量。杂色曲霉毒素(ug/kg)=(S×Y×V)/10X 式中:S=与样品液荧光强度相当的标准液uL数:Y=标准液浓度(ug/mL);V=样品液最后稀释的uL数;X=与标准点S荧光强度相当的样品液uL数。

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