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禽呼肠孤病毒S1基因扩增克隆与鉴定

谢芝勋  廖敏  庞耀珊  谢志勤  邓显文  刘加波  李康然  
【摘要】:禽呼肠孤病毒(ARV)在世界范围内广泛存在,主要引起鸡的病毒性关节炎和腱鞘炎,感染鸡群常由于生长缓慢或阻滞,饲料报酬低,屠宰废弃率高,以及机体免疫功能下降,而给养鸡业造成严重经济损失。ARV的核酸为双链RNA,其基因组分成L(大)、M(中)、S(小)三组,其中S组的基因S1编号σ_3蛋白,σ_3蛋白携带有病毒型特异性抗原决定簇能刺激机体产生保护性中和抗体,对S1基因及其编码的蛋白进行深入研究对有效防制ARV的感染具有重要意义。 本文根据ARV S1基因序列设计合成了一对特异性引物,引物的两端分别带有Hind Ⅲ,Pst Ⅰ限制性内切酶的酶切位点,用设计的引物对ARV S1133和1733两毒株抽提的核酸分别进行RT—PCR,均扩增出了ARV两毒株长为540bp的S1基因片段,将扩增到的S1基因片段和载体pBluescript都分别用Hind Ⅲ和Pst Ⅰ酶切,两酶切产物按适当的比例混合后,在T4DNA连接酶的作用下,通过粘端接法连接起来,然后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞,在含有Amp、X—gal和IPTG的LB平板上筛选重组菌,经PCR和限制性内切酶分析鉴定,获得了两种重组质粒ARVS1133S1—pBluescript和ARV1733S1—pBluescript。ARV S1基因克隆成功,为从分子水平上进一步了解S1基因结构及其编码的σ_3蛋白的功能以及基因工程疫苗的研制打下基础,同时也为核酸探针的诊断和序列测定提供了材料。

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