基于重组酶聚合酶扩增技术检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法的建立

【摘要】：黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaicvirus,CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员之一,是世界范围内葫芦科作物上一种重要检疫性病毒,严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物生产。CGMMV可以通过种子、花粉、土壤、水和昆虫媒介以及机械接触传播。感染CGMMV植株叶片上会出现明显的花叶症状,生长发育迟缓,果实畸形,最终导致产量降低,从而引起巨大的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),一种新型的等温DNA扩增和检测技术,针对CGMMV-lnxg分离物基因组(GenBank ID:KY040049.1)序列的外壳蛋白序列设计特异性引物,引物设计长度为35bp,无需考虑Tm值。以摩擦接种CGMMV的葫芦叶片为材料,提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,通过反应条件优化,特异性及灵敏度检测等试验,建立了一种新的快速检测CGMMV的方法。结果显示,RPA方法在37℃条件下恒温反应30min即可完成扩增,检测得到约180bp特异性条带,且与西瓜花叶病毒、小西葫芦花叶病毒、南瓜花叶病毒等其他葫芦科病毒均无交叉反应,特异性良好;反应产物分别使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(Sangon Biotech)、苯酚/氯仿溶液、65℃加热10min、95℃加热10min、5%SDS溶液及10%SDS溶液进行纯化处理后,试剂盒处理产物条带明亮单一;灵敏度试验分析表明,RPA法的检测灵敏度为3.02x101拷贝,使用普通PCR方法在此稀释度也可检测到目的条带,灵敏度较高。本文建立的RPA方法高效、便捷、省时、特异性好,为田间及基层实验室快速检测CGMMV提供了一种新的诊断方法。