希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体库的构建与筛选

【摘要】：希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,分类地位属于真菌门,半知菌亚门,炭疽菌属;主要为害白菜、甘蓝、萝卜、花椰菜等十字花科植物,严重影响其品质和产量。农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefacien-mediated transformation,ATMT)技术以其方法简单,转化效率高,单拷贝转化比例高等优点被广泛应用于构建丝状真菌基因插入突变体库。本研究以质粒pTFCM为转化载体,该质粒带有潮霉素磷酸转移酶基因,采用农杆菌介导的方法对希金斯刺盘孢菌株的分生孢子进行转化,获得2000多个T-DNA插入转化子,随机挑选转化子用潮霉素特异引物对其进行了PCR鉴定,均能扩增出潮霉素磷酸转移酶基因片段,说明T-DNA片段已经成功插入到希金斯刺盘孢的染色体上。通过比较突变体与野生菌株的生长速度、菌落形态及致病性等生物学特性,将筛选出的突变体分为5种类型,即Ⅰ类:在PDA培养平板上生长速度缓慢,菌落不能均匀扩展,与野生型菌株的生长速度存在显著差异,共6株;Ⅱ类:突变体生长正常,但菌落中央的菌丝塌陷,仅1株;Ⅲ类:气生菌丝极少,紧贴培养基表面生长,菌落颜色明显加深,1株:Ⅳ类:产孢缺陷型突变体,完全丧失产孢能力或产孢很少,10株;Ⅴ类:接种拟南芥后致病力减弱的突变体,3株。目前正在研究已筛选的突变体的生物学特性,克隆与生长发育及致病性相关的基因。