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玉米弯孢霉叶斑病菌Brn1基因功能分析

刘铜  刘力行  高士刚  刘志诚  陈捷  
【摘要】:玉米弯孢霉叶斑病菌[Curvularia lunata(Wakker)Boed]是一种引起玉米叶斑病的丝状病原真菌。该菌在致病过程中可以产生一种DHN黑色素,沉积在附着孢壁,积累足够的膨压来穿透植物组织侵入寄主,同时也分泌出一种重要致病因子——毒素,破坏寄主细胞来诱发典型的弯孢菌叶斑病症状。本实验前期研究利用蛋白质组学方法,比较研究强毒力菌株和弱毒力菌株蛋白质图谱差异,鉴定出一个Brn1蛋白,并且通过RACE技术,克隆出了Brn1全长基因。该基因编码的氨基酸序列与其他植物病原真菌的DHN黑色素合成途径中的1,3,8-三羟基萘还原酶具有高度的相似性。从以上可以推测,Brn1基因有可能控制DHN黑色素的合成,同时也有可能调控其他致病因子而改变该病菌的致病力。为了进一步验证Brn1基因与致病性的关系,我们采用RNA干扰方法对该基因进行了敲除。首先,我们根据已知的Brn1基因序列为探针,通过Southern Blotting确定了Brn1基因以3~4拷贝的形式存在于基因组中。然后试验以质粒pSilent-1为基础构建了Brn1基因的RNA干扰载体pSilent-brnl,并利用原生质体-氯化钙-聚乙二醇(CaCl_2-PEG)转化方法获得了10个抗潮霉素的转化子,其中转化子T1,T4,T5在菌丝颜色上表现出不同程度的白化现象。对这3个转化子进行Southern blotting和RT-PCR验证,发现其干扰载体pSilent-brnl中Brn1基因序列的发夹结构已经整合到基因组中,并且Brn1基因表达有不同程度被抑制,其中转化子T5有79%的Brn1基因表达被沉默,使DHN黑色素合成受阻出现白化现象。另外在对转化子T5产毒及致病力分析发现毒素合成被抑制,致病力明显下降。这些结果表明了,Brn1基因是玉米弯孢霉叶斑病菌黑色素合成途径中的关键基因,也是影响毒素合成代谢的一个重要基因。

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