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洋葱伯克氏菌群在毛竹根围的分布及其基因型多样性研究

楼妙苗  方媛  谢关林  
【摘要】:洋葱伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex,Bcc)是一组表型相近但基因型不同的复合物,目前至少有九个基因型。该菌广泛存在于植物根围、土壤、水以及田径场等城市环境中,一方面Bcc菌具有良好的生防潜能,可以净化环境,促进植物的生长;另一方面它又是一种人体条件致病菌,可使囊性肺纤维化(CF)病人和慢性肉芽肿疾病(CGD)患者感染后致死。目前国外已有大量关于Bcc菌的研究,但国内外尚无Bcc菌在毛竹根围的记录。本研究以杭州的三大竹类观赏区(杭州植物园、黄龙洞以及云栖竹径景区)为土壤采集点。每个采样点均用五点取样法收集50-100株毛竹根围土壤,放于消毒的塑料袋中,及时送于实验室进行样本根围细菌的分离。对分离到的细菌首先进行表型的初步鉴定,然后对经表型鉴定的Bcc疑似菌株采用recA基因片断的特异性扩增,将菌株准确鉴定到洋葱伯克氏菌群水平。对确认的Bcc菌株采用限制性内切酶HaeⅢ对其recA基因片段进行了限制性酶切(RFLP)分析,以探测Bcc菌的遗传多样性。最后通过基因型特异性PCR确定各菌株的基因型,挑取代表菌株测其RecA基因序列用于聚类分析,以便更好的确定鉴定的准确性。从三个采样地点中共获得300余株Bcc菌,其中70余株分离自PCAT培养基,230余株分离自TBT培养基。鉴定为Bcc的菌株都采用限制性内切酶HaeⅢ对其recA基因片段进行了限制性酶切(RFLP)分析,获得了多种酶切图谱,并且有新的酶切图谱类型出现,说明了Bcc菌在毛竹根围的基因型具有高度多样性。B.pyrrocinia(基因型Ⅸ)与B.cepacia(基因型Ⅰ)的酶切图谱不同,但基因型特异性PCR所用引物相同,说明更加有效的区分方法仍待研究。目前为止共获得了5个基因型,部分菌株不属于基因型Ⅰ-Ⅸ种的任何一种,可能为刚报道的新基因型,仍待进一步的鉴定。己鉴定的5个基因型分别为B.cepacia(基因型Ⅰ),B.cenocepacia(基因型Ⅲ),B.stabilis(基因型Ⅳ),B.anthina(基因型Ⅷ)和B.pyrrocinia(基因型Ⅸ)。其中B.pyrrocinia菌株的数量最多,其次为B.cenocepacia和B.anthina。尽管之前有报道表明B.pyrrocinia在环境中分布较为广泛,但B.pyrrocinia作为植物根围土壤中的优势基因型则仍属首次发现。国外的研究表明,自然界中以B.cenocepacia和B.ambifaria的分布最为广泛,2007年张立新首次报道B.viemamiensis为水稻根围的优势基因型而本研究则发现B.pyrrocinia为毛竹根围的主要基因型,说明Bcc菌优势基因型的存在与其所生长的自然环境具有较大的联系。B.cenocepacia由于其强致病性一直备受关注,此次共从毛竹根围土壤中分离到20多株,较之国外的研究来说所占总Bcc分离物的比例较少,但仍然印证了自然环境可能是人体条件致病菌的"天然储存库"这一假设。

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