玉米大斑病菌漆酶基因生物信息学分析及功能验证

【摘要】：漆酶(Laccas EC 1.10.3.2)是一种催化中心含有多个铜离子的多酚氧化酶,也称为多铜氧化酶,其底物包括多酚类、芳胺类等多种物质,具有广泛的底物范围。真菌中,漆酶主要与菌体形态建成、DHN黑色素合成、病原菌致病性和脱毒作用有关。许多丝状真菌基因组中包含不同数量的漆酶编码基因,本研究根据真菌漆酶高度保守的Cu~(2+)结合位点,对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)基因组数据库进行生物信息学分析识别,筛选得到了9个与漆酶相似度较高的蛋白,且均为未知功能蛋白。将获得的9个蛋白进行BlastP分析,初步推测其中4个为漆酶(EOA82311.1、EOA90070.1、EOA85322.1、EOA85022.1)。SignalP4.1.预测结果表明:EOA90070.1几乎不存在信号肽,其他蛋白具有信号肽的可能性在98%以上;ProtComp V 9.0亚细胞定位预测结果表明:4个蛋白均为胞外分泌型。通过比对GenBank中漆酶的氨基酸序列,绘制了玉米大斑病菌漆酶的系统进化树。根据4个假定的玉米大斑病菌漆酶序列,利用PCR技术克隆获得了其中2个蛋白的编码基因,分别命名为StLAC1、StLAC2。利用基因敲除技术分别创制了StLAC1、StLAC2基因缺失突变体,通过分析突变体对基因功能进行了验证,明确了StLAC1、StLAC2在玉米大斑病菌黑色素合成、附着胞穿透力和分生孢子形成等方面具有重要作用。本研究有助于进一步研究玉米大斑病菌漆酶基因家族的功能及作用,为玉米大斑病菌致病机理研究奠定理论基础。