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FIASCO法在小麦锈菌分子标记中的应用研究

王曦  刘太国  高利  刘博  陈万权  
【摘要】:小麦秆锈病是由小麦秆锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)引起的一种真菌性病害,是中国乃至全世界所有产麦国家的一类重要病害。传统的病害诊断主要依据病原菌生物学及病害症状特征,耗时费工,难以满足病害的快速、高通量检测需求。因此,研发简单快捷、灵敏准确的小麦秆锈病快速诊断和检测技术,对于鉴别病害、提高病害预报预测的准确性和时效性均具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究首次利用FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats,基于AFLP技术高效微卫星片段筛选)方法开发小麦秆锈菌特异性SSR分子标记。选用来自我国7省(市、区)的24个小麦秆锈菌生理小种的夏孢子,采用改良的CTAB/SDS法成功提取了秆锈菌夏孢子基因组DNA。采用FIASCO法富集微卫星片段,具体过程为:对基因组DNA进行酶切、连接、预扩增等步骤获得微卫星片段后,利用链霉亲和素包被的磁珠,在液相杂交体系中将微卫星片段与生物素探针进行特异性杂交并形成共价键结合在磁珠上,然后通过一系列的洗脱过程,达到微卫星片段富集的目的。产物经由微卫星文库构建、特异性引物设计等步骤,最终得出8对SSR引物,可扩增出小麦秆锈菌的特异性DNA片段。经过多次重复验证表明:此8对引物对24个供试的小麦秆锈菌生理小种均可扩增出特异性片段,而在小麦叶锈菌、条锈菌、白粉菌、赤霉菌、矮星黑粉菌、光腥黑粉菌、网星黑粉菌、散黑穗病菌和玉米丝黑穗病菌中,则未扩增出相应片段。灵敏度和可靠性分析结果表明:用此8对引物可检测到至少0.01 ng/μL的基因组DNA浓度,在基因组DNA浓度在0.01 ng/μL水平上,其检测可靠性达到100%。染病叶片试验表明,小麦秆锈菌侵入寄主后30 h,即可利用所开发的引物检测到秆锈菌的特异性DNA片段。进一步的工作是探讨FIASCO法对某特定生理小种分子标记开发的可行性以及所开发的SSR分子标记在群体遗传多样性中的应用。

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