【摘要】：麦长管蚜Sitobion avenae是一类以小麦为寄主刺吸为害的小型昆虫,不仅使小麦减产,还能传播病毒病,对我国小麦主产区的生产造成严重灾害。麦长管蚜能借助风力长距离迁移,依靠极其敏锐的嗅觉定位能力,可以从高空准确降落到处于苗期生长的麦株上定殖。本文主要对麦长管蚜的嗅觉蛋白的功能进行分析,试图揭示麦长管蚜与定殖寄主间的化学通讯联系,为解析麦长管蚜的致灾规律及防控技术提供详实的基础控制理论。本研究克隆了触角的2个嗅觉基因(SaveOBP2和SaveOBP3),导入pET30表达型质粒的多克隆位点中,再转入Rosetta化学感受态细胞中受控表达,经SDS-PAGE证实两种嗅觉蛋白在细菌中的表达。利用金属亲和层析技术对这两种蛋白成功地分离和纯化,纯化的蛋白可以被His标签肽的抗体检测到,最后利用重组牛肠激酶切除蛋白的His标签肽,获得了可用于功能研究的纯蛋白。借助荧光探针N-苯基-1-萘胺(N-pheny1-1-naphthylamine,1-NPN),开展了两种重组气味结合蛋白的结合活性的测定。根据前人的研究结果,我们已经知道气味结合蛋白折叠后,内部形成疏水的洞穴结构,以容纳外界的气味分子。气味分子就借助洞穴入口处的识别氨基酸的牵引作用进入到洞穴中,开始了化学信息的被动运输及后续的信号传导。由于气味结合蛋白洞穴内部以疏水基团为主,1-NPN与疏水基团作用后会产生激发荧光,而蛋白能够识别并结合随后的竞争性气味分子,替代了洞穴中的部分1-NPN,与此同时发射荧光值发生了改变。我们对两种蛋白与绿叶气味的结合特性进行了比较研究。利用替代半数1-NPN的荧光值所需浓度代入公式K_c=[IC_(50)]/(1+[1-NPN]/K_(1-NPN))计算了9种常见绿叶气味的竞争解离常数(K_c),从公式中可以看出,K_c值越小,蛋白结合该种气味的能力越强。结果表明,OBP2对反-2-己烯醛(9.381;14.023)和顺-3-己烯醇(9.769;13.144)的结合能力要强于OBP3;而两种蛋白对顺-3-己烯醛、顺-2-己烯醇、反-2-己烯醇、4-己烯-1-醇、正己醇、顺-3-己酰乙酸酯和反-2-己酰乙酸酯的结合活性非常接近。此外,我们也测试了两种蛋白与其他气味的结合能力,发现肉桂醛、香叶烯和苯甲醛的K_c值比绿叶气味小的多,可能是它们具有某种类似于芳香族探针1-NPN的化学结构,因此更容易被气味结合蛋白识别。相比OBP2对α-松油醇(13.481;7.843)的结合活性,OBP3的结合能力明显更强,说明α-松油醇可能是OBP3的主要识别气味。我们还发现测试气味为8个碳原子以上的直链化合物都不能被两种蛋白结合。OBP3对高浓度的蚜虫报警信息素E-β-法呢烯才表现出了适当的结合活性,可能是由于蚜虫成功识别危险信号须在小范围内的缘故。蚜虫的化学通讯是个极其复杂的系统,化学信息的初始识别需要多种气味结合蛋白的分工协作。因此,对于自然界中长链醇、醛、酯类等的信息识别则可能由气味结合蛋白(OBP4～OBP10)来实现。