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荔枝霜疫霉M90的克隆与功能分析

江立群  叶文武  司徒俊键  杨新宇  孔广辉  习平根  王源超  姜子德  
【摘要】:由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的霜疫病是我国荔枝生产过程中为害最严重的病害。该病原菌隶属卵菌,为二倍体生物且在遗传进化上与真菌的亲缘关系甚远,致使用于防治真菌病害的广谱性杀菌剂对其防治效果不佳,且先前的基因敲除技术不适于研究其功能基因。为研究该病原菌的致病机制,本研究基于外源双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默策略与聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化技术对荔枝霜疫霉M90基因在病原菌生活史和致病性方面的作用与功能进行了研究,主要结果如下:1.通过对荔枝霜疫霉全基因组进行分析,筛选到一个与致病疫霉(Phytophthora infestans)RNA结合蛋白M90相似度达73%的同源蛋白,将其命名为P. litchii M90(PlM90),该基因在卵菌中高度保守,尤其是其RNA结合结构域。2.采用实时荧光定量RT-PCR技术对荔枝霜疫霉M90基因在不同生长发育时期与侵染阶段的转录水平进行了研究,结果显示M90基因在孢子囊、游动孢子、休止孢阶段的转录水平是菌丝阶段的2~3倍,在卵孢子阶段的转录水平是菌丝阶段的24倍,在休止孢萌发与侵染阶段的转录水平均明显低于菌丝阶段;表明M90基因可能参与调控荔枝霜疫霉有性生殖与无性生殖过程,而在侵染过程中的作用相对较弱。3.构建p HAM34::PlM90基因沉默载体并通过PEG介导的原生质体转化、基因组PCR验证及实时荧光定量RT-PCR分析,成功地筛选到3个荔枝霜疫霉M90基因沉默转化子,沉默效率分别为98.9%、99.7%和99.6%;3个M90基因沉默转化子的卵孢子产量分别比荔枝霜疫霉野生型减少99.6%、95.4%和97.3%,菌丝生长速率明显减慢但更加致密,游动孢子的释放与休止过程均滞后,而孢子囊产量、休止孢萌发与致病性方面均无明显差异,表明M90基因的沉默严重影响荔枝霜疫霉的有性生殖过程,还影响其菌丝生长、游动孢子释放与休止等无性发育阶段,而不影响其孢子囊产量、休止孢萌发及致病性。

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