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根癌农杆菌介导申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变的研究

王丽  张艳华  李广泉  燕巍  尚博菲  
【摘要】:申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)是一种双相型病原真菌,引起人和动物的孢子丝菌病(Sporotrichosis)。本研究首次成功建立了根癌农杆菌介导的申克氏孢子丝菌遗传转化体系,并探讨了影响转化效率的主要因素。该转化体系效率达600个转化子/10~6个分生孢子,可在短期内获得大量T-DNA(TransferDNA)插入突变体,且这些突变体有丝分裂稳定。己获得突变菌株2130株,初步建立了小范围的申克氏孢子丝菌T-DNA标签的突变体库,并得到了一些生长、发育、代谢等表型发生改变的突变体,为揭示申克氏孢子丝菌分子机理、探讨致病机制等奠定了坚实的基础。申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变体的分子分析表明,T-DNA已插入到申克氏孢子丝菌基因组中,其中87%为T-DNA单拷贝插入,13%为T-DNA多拷贝插入,利用TAIL-PCR即可获得T-DNA插入位点的侧翼序列,表明根癌农杆菌介导的申克氏孢子丝菌遗传转化是一种有效的插入突变策略,是进行申克氏孢子丝菌功能基因组学研究的有力工具。筛选申克氏孢子丝菌T-DNA插入突变体,获得产色素缺陷菌株JLCC32757-M2013。与野生型相比,该菌株失去产色素的能力,其菌丝、分生孢子形态均发生明显改变。分子分析表明,T-DNA以单拷贝插入到申克氏孢子丝菌类泛素结合酶E2基因(SsUBCc),破坏菌体内类泛素结合酶E2基因的正常表达,导致SsUBCc基因和色素合成相关基因在转录水平的表达量降低,菌株毒力下降。同时,为充分利用T-DNA插入突变体库进行申克氏孢子丝菌反向遗传学研究,本研究以每100个突变体为单位,构建了21个突变体池和DNA池,既保证实验的可靠性又方便从突变体库中筛选靶基因突变的菌株。

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