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蒙古口蘑、紫带栓菌漆酶和杏鲍菇植酸酶的分离纯化与理化性质研究

李淼  刘芹  刘庆洪  王贺祥  
【摘要】:漆酶和植酸酶在农业、医疗、畜牧及环保等领域具有重要的应用前景,是极具研究意义的生物资源。本研究通过DEAE-cellulose、CM-cellulose和Q-sepharose离子交换层析,Affi-gel blue gel亲和层析、凝胶过滤层析等方法,以大型真菌蒙古口蘑Tricholoma mongolicum的菌丝体和发酵液、紫带栓菌Trametes purpurea的发酵液为材料,分离纯化出两个新的漆酶(laccase),以杏鲍菇Pleurotus erynguii的新鲜子实体为材料,分离纯化出一个新的植酸酶(phytase)。蒙古口蘑漆酶是分子量66kDa的单亚基蛋白,其N-端氨基酸序列为GIGPVADLYVGNRIL,与已报道的大型真菌漆酶氨基酸序列具有一定的同源性。该漆酶最适反应温度为30℃,最适反应pH为2~3。大部分金属离子对该酶活性无显著影响,Cu~(2+)对其具有明显的促进作用,Fe~(2+)和Al~(3+)对其具有抑制作用,且作用效果随离子浓度的增大而增强。该酶具有广泛的底物多样性,最适底物是2,2′-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸),即ABTS,按照催化活性由强到弱依次为:ABTSN,N-二甲基-1,4-苯二胺对苯二酚邻苯二酚愈创木酚连苯三酚。以ABTS为底物,在30℃、pH2.2的条件下,该酶K_m为2.3μmol/L。体外抑制人肝癌细胞株Hep G2和人乳腺癌细胞株MCF 7的IC_(50)分别为1.4μmol/L和4.2μmol/L,抑制HIV-1逆转录酶的IC_(50)为0.65μmol/L。紫带栓菌漆酶分子大小是67kDa,N-端部分氨基酸序列为GIGPVADLTITNAAVSPDGF,与目前已知大型真菌漆酶N-端氨基酸序列具有一定的同源性。该漆酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH在3~4之间,Hg~(2+)和Pb~+对酶活表现出明显的抑制作用,并且随离子浓度的增大抑制作用逐渐增强,Fe~(2+)和Mn~(2+)对漆酶活性具有一定的促进作用。该酶的最适作用底物是ABTS,按照催化活性由强到弱依次为:ABTS对苯二酚连苯三酚愈创木酚≈N,N-二甲基-1,4-苯二胺邻苯二酚。以ABTS作为底物,在70℃、pH3.6的条件下,紫带栓漆酶K_m为596.8μrnol/L。体外抑制小鼠白血病细胞L 1210和人肝癌细胞株Hep G2的IC_(50)分别为1.2μmol/L和5.2μmol/L,抑制HIV-1逆转录酶的IC_(50)为1.6μmol/L。杏鲍菇植酸酶的分子量是14kDa,N-端部分氨基酸序列为ADNVYRHDNN,与其他微生物来源的植酸酶相比同源性不明显。该酶最适反应温度为37℃,最适反应pH是4.8。对蛋白酶和大部分金属离子具有良好的耐受作用,Cd~(2+)能够促进其活性,Cu~(2+)对植酸酶活性表现出一定的抑制作用。对植酸钠、AMP、ADP、ATP、Fructose-6-Phosphate、Glucose-6-Phosphate和β-Glycerophosphate等多种底物均具有良好的降解效果。以植酸钠作为底物,在37℃、pH4.8的条件下,杏鲍菇植酸酶的K_m为0.3 1μmol/L。对人鼻咽癌细胞株CNE 2、人肝癌细胞株Hep G2、人乳腺癌细胞株MCF7的体外增殖和HIM-1逆转录酶具有抑制作用,IC_(50)分别为1.9μmol/L、2.9μmol/L、1.0μmol/L和0.16μmol/L。

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