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禾本科植物内生真菌总DNA的快速提取和NRPS基因的检测

王永  纪燕玲  陈永敢  王志伟  
【摘要】:禾本科植物内生真菌能与冷季型禾草形成稳定的互利共生关系,一般不会使宿主致病,而且会给宿主带来对干旱、病虫害及动物啃食等的抗性。对各种昆虫和草食动物的抗性主要是由真菌/宿主植物共生体产生的次级代谢产物所导致的。这些次级代谢产物中,有些重要生物碱是由非核糖体肽合成酶(NRPS,Non-ribosomal peptide synthetase)催化合成的。近年来,关于NRPS催化合成的代谢物的研究日新月异,越来越多的受到人们的关注。目前,真菌总DNA提取主要有SDS法、CTAB法等常规方法。这些方法是挑取新鲜菌丝于液体GY培养基中进行1个月的培养,再进行液氮研磨和不断地抽提,提取步骤繁琐且耗时,难以适以大量的样品的处理。本研究采用了新的真菌总DNA的提取方法(Chi 2009)提取了禾本科植物内生真菌的总DNA,并进行了NRPS基因的检测。相对于SDS法,这种方法快速安全、省时省力,整个提取过程大约40分钟即可完成。提取总DNA时,以生长在平板上的菌丝为起始材料,在将其在提取液中用玻璃棒捣碎真菌细胞壁后直接提取。仪器要求简单、操作简便,所获得的DNA质量可用于后续的PCR、基因克隆以及其它高通量测试的需求。本研究成功地从20个不同内生真菌菌株中提取出了DNA,进行了NRPS2、NRPS5和NRPS8基因的PCR检测,获得了高质量的DNA片段。最后,通过对PCR产物的测序和序列比对分析,确认了PCR产物的准确性。这种快速、简便、安全的真菌总DNA提取法可能还可以用于其它真菌或其它在生物的总DNA的提取,适合高通量的检测技术的实施。

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