被毛孢OWVT-1丝氨酸蛋白酶HR的分离纯化、性质研究及cDNA克隆

【摘要】：食线虫真菌洛斯里被毛孢OWVT-1(Hirsutella rhossiliensis OWVT-1)是通过黏性孢子黏着于线虫并侵染和消解线虫的线虫内寄生真菌,由于在自然界对线虫寄生率高,寄生性强,且与线虫抑制性土壤有关、自然条件下为专性寄生菌,因而极具生物防治潜力。对金龟子绿僵菌(Metarhizium anopine)侵染昆虫过程中类枯草杆菌蛋白酶(Prl)的研究已经证明丝氨酸蛋白酶是真菌侵染无脊椎动物过程中的关键酶,蛋白酶为致病性决定因子。通过对高效食线虫真菌洛斯里被毛孢OWVT-1侵染线虫过程中相关蛋白酶的研究,可以为真菌侵染线虫的分子机理提供理理论基础,同时克隆致病性相关的蛋白酶基因,为改良及构建工程菌株提供坚实的基础。本研究利用线虫作为诱导物液体发酵培养洛斯里被毛孢OWVT-1,对发酵液通过粗分级分离、离子交换层析和凝胶过滤层析分离提纯获得了一个分子量为31 kDa的蛋白酶HR。生物学测定表明该酶对大豆胞囊线虫二龄幼虫具有致死作用。同时测定了该酶的理化特性:在75℃附近酶活力最高,对热不敏感;随着pH的增加酶的稳定性升高,与胆碱酯酶具有相似的pH曲线;能够降解特异性底物AAPE(Suc-Ala-Ala-Pro-GIu-PNA);抑制剂SSI和CI-2抑制该酶的活性。通过对分离提纯的丝氨酸蛋白酶FIR分子N-端氨基酸序列测定,得到N-端的氨基酸序列为AVIDTGVEASHPEF,序列分析表明与其它致病相关丝氨酸蛋白酶具有高度同源性。根据N-端氨基酸序列设计简并引物,提取被毛孢OWVT-1的总RNA,3‘RACE获得了编码该酶HR成熟肽基因(1000bp)的克隆子。经丝氨酸蛋白酶HR的基因序列分析表明,该酶与其它致病相关丝氨酸蛋白酶基因序列具有较高的同源性,其中,与线虫卵寄生性真菌如Paecilomyces lilacinus、Pochonia chlamydosporium及M anisopliae var.anisopliae同源性较高,而与捕食线虫真菌Arthrobotrys Oligospora同源性较低(45%)。