FKBP8在大负荷运动诱导大鼠骨骼肌线粒体自噬中的作用

【摘要】：研究目的:目前研究成果表明,大负荷运动导致骨骼肌微损伤的病理机制与细胞自噬密切相关。自噬是关键的细胞降解过程,可选择性清除受损细胞器(线粒体)防止触发凋亡途径。目前已知介导线粒体自噬的受体蛋白包括PTEN诱导激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)、Nix(BCL2/adenovirus E1B protein-interacting protein 3-like,BNIP3L)、BNIP3、FUNDC1(FUN14 domain containing 1)、Bcl-2样蛋白13、抗增殖蛋白等。最近研究发现一种线粒体外膜蛋白FKBP8/FKBP38亦是介导线粒体自噬的关键受体,并已成为哺乳动物细胞线粒体自噬的分子调控新靶点。研究发现FKBP8可通过特有的LIR氨基酸序列与自噬体标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)相结合,共同调控线粒体选择性自噬过程,且该作用不依赖于PINK1/Parkin(Parkinson protein 2)通路。鉴于其已明确的功能及调控信号,可能在运动诱导的骨骼肌线粒体自噬中发挥重要作用,但目前尚未见相关文献报道。本实验拟通过建立离心运动诱导的骨骼肌损伤动物模型,观察运动后不同时相下大鼠骨骼肌线粒体定量蛋白热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)以及线粒体FKBP8、自噬体膜标记物LC3的表达变化,探讨FKBP8在大负荷运动诱导大鼠骨骼肌线粒体自噬中的作用及其可能机制,为研究运动性骨骼肌损伤的发生机理提供理论依据。研究方法:8周龄健康雄性Spraque Dawley(SD)大鼠,随机分为安静对照组(Control,C,n=8)和大负荷运动组(Exericse,E,n=40)。C组大鼠自由活动,E组进行一次大负荷离心运动,并选取运动后即刻、运动后12h、运动后24h、运动后48h、运动后72h共5个时相作为测试点,每个时相各8只。采取一次持续性下坡跑,跑台坡度为-16°,速度为16m/min,运动时间为90 min。运动后按时相分批取材,分离双侧比目鱼肌。采用透射电镜观察大鼠骨骼肌线粒体超微结构与自噬体的形成变化,应用Westernblot方法检测大鼠比目鱼肌HSP60以及线粒体FKBP8、LC3的蛋白表达。研究结果:1.电镜结果显示,C组大鼠骨骼肌Z线整齐且分布均匀,肌膜下线粒体大小均一,膜结构完整,嵴饱满;E组大鼠在运动后即刻肌膜下线粒体大量积聚,自噬体较少,线粒体肿胀,嵴结构发散,早期自噬小泡包裹尚可识别的线粒体;运动后12h,Z线部分断裂,肌膜下线粒体大量聚集,出现大量不同阶段的自噬体,线粒体部分膜结构模糊,此时线粒体损伤程度最高;运动后24h,Z线变清晰,肌膜下线粒体数量减少,自噬体变少,膜结构较清晰;运动后48h,Z线清晰,两侧线粒体分布不均,但优于运动后12h,肌膜下线粒体再次积聚,自噬体较少,线粒体大小不一,部分膜结构破裂,后期自噬小泡包裹薄层状的结构;运动后72h,线粒体形态恢复,Z线清晰且排列整齐,线粒体分布均匀,肌膜下线粒体少量积聚,未观察到明显自噬体,线粒体恢复长线形结构,膜结构清晰,嵴饱满密集。2.Western blot结果显示,与C组大鼠相比,E组大鼠在一次大负荷运动后比目鱼肌线粒体FKBP8和LC3蛋白表达明显升高,HSP60蛋白表达显著下降。(1)运动后即刻FKBP8蛋白表达是C组的1.9倍,运动后12h仍显著高于C组(P0.05),运动后24h至72h蛋白表达略有降低,但仍高于C组水平;(2)与C组相比,线粒体LC3蛋白表达在运动后即刻和12h显著上调(P0.05),分别是C组的1.7倍和1.8倍,最高峰出现在运动后12h,运动后24h至72h逐渐回落,运动后72h明显低于运动后即刻和12h水平(P0.05);(3)运动后即刻HSP60蛋白表达略高于C组水平,但运动后12h表达下调,此时较C组差异具有显著性(P0.05),此后逐渐回升,至运动后72h明显高于运动后12h水平(P0.05),且略高于C组。研究结论:一次大负荷运动后大鼠骨骼肌自噬受体FKBP8和自噬体膜标记物LC3的蛋白表达明显上调,同时反映线粒体数量的线粒体基质蛋白HSP60表达显著下调,峰值均出现在运动后12h,且此时线粒体损伤最为严重,出现大量双层膜结构的自噬体。以上结果提示一次大负荷运动可诱导骨骼肌中FKBP8介导线粒体自噬的发生。后续研究可通过检测自噬相关蛋白FKBP8与LC3在线粒体中的共定位情况以及线粒体功能以进一步探索大负荷运动诱导骨骼肌线粒体自噬的具体机制及FKBP8在其中的作用。