耶氏解脂酵母油脂积累分子机制的初步探索

【摘要】：本研究主要探索在氮限制培养基(碳源为甘油,氮源为酒石酸铵和酵母提取物)中耶氏解脂酵母油脂积累的机制耶氏解脂酵母在氮限制培养基中发酵培养,并测定发酵过程中几种与油脂积累代谢相关的酶活性变化,同时检测分泌到细胞外柠檬酸和异柠檬酸含量。根据NCBI公布的耶氏解脂酵母苹果酸酶基因(YALI0E18634g),将其克隆至原核表达载体pET28a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组苹果酸酶表达Ni-NTA亲和层析柱纯化得到苹果酸酶重组蛋白质,测定重组苹果酸酶对辅酶NAD和NADP的K_m值。结果显示N源耗尽时,AMP脱氨酶活性增加而NAD依赖型异柠檬酸脱氢酶活性降低,这可能是酵母细胞油脂积累的开始。细胞内能提供NADPH的三种酶(苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、NADP依赖型异柠檬酸脱氢酶)的活性变化并没有和油脂积累相关联。ATP柠檬酸裂解酶活性变化与油脂积累变化趋势一致,可能是耶氏解脂酵母油脂积累的关键酶。最终酵母细胞内油脂含量占细胞干重的18.1%,且同时分泌大量的柠檬酸和异柠檬酸,浓度分别达到51.79 g/1和14.31g/l。原核表达得到的重组苹果酸酶对NAD的K_m为1.57 mM,V_(max)为714.29nmol/min*mg,而重组苹果酸酶虽能利用NADP,但其对NADP的亲和力很低,无法计算K_m值,揭示苹果酸酶(YALI0E18634p)并不能提供还原力NADPH,可能不是耶氏解脂酵母油脂积累的关键酶。