旋转壁式生物反应器构建组织工程骨

【摘要】：目的利用生物反应器促进种子细胞在材料中的生长、增殖和分化,在体外得到较大量的组织,是构建组织工程产品的重要手段。本研究利用旋转壁式生物反应器(Rotating Wall Vessel,RWV)构建组织工程骨与静态环境培养中构建的组织工程骨进行比较,为研发适合构建组织工程骨的生物反应器提供理想依据。方法将来源于新西兰大耳白兔颅骨的成骨细胞标记绿色荧光蛋白,以一定密度接种在一定体积的生物衍生骨支架材料上,24h后置RWV中,启动RWV外部的温控、气控以及培养基的循环装置,将内外筒的转速调至10r/min,每12h时取一次样,分别进行乳酸、葡萄糖、pH值和碱性磷酸酶的测定。第3、5和8天时取出标本通过扫描电镜、激光共聚焦显微镜、组织学、免疫组织化学、流式细胞仪、细胞计数、染色体倍体分析等手段比较利用RWV构建的组织工程骨与静态培养构建的组织工程骨差异。结果通过RWV构建的组织工程骨优于静态培养构建的组织工程骨。反应器中细胞的生长速度和葡萄糖的消耗量高于静态,而乳酸的产生量低于静态;成骨细胞长入支架的微孔中比静态更多地分泌胞外基质和钙化结节生成;细胞生成量是静态的5.2倍;其蛋白质表达和染色体倍体证实反应器中的成骨细胞保持了正常活性及表型。结论在组织工程骨构建中,营养物的耗竭、代谢副产物的积累、贴壁表面不足等原因均会影响细胞在支架上的生长和功能表达。除了细胞和支架材料本身的性能外,生物反应器培养环境中流体力学因素调节组织工程骨的沉降形态和机械性能也至关重要。本研究采用的RWV整个培养系统中无机械推进器、气泡或搅拌器,使破坏性应力减到最小,而其内液体为动态层流,为细胞营养物质的传递,代谢产物的递出提供了通道。本研究结果细胞的生长速度及葡萄糖的消耗量均高于静态,同时乳酸的产生量低于静态所形成的组织与正常骨相比较,胶原蛋白达30%、黏多糖达8%、机械强度佳,各种系数可达正常骨的18%,成骨细胞保持代谢活性及表型的稳定,表明RWV的培养较静态培养更有效率。通过RWV构建的组织工程骨是否在应用中更有效,体内和进一步的研究将另文报道。