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组织工程化人工神经的系列研究

刘小林  
【摘要】:目的通过对组织工程化人工神经构成要素的基础研究,及运用组织工程学原理构建组织工程化周围神经移植体修复大鼠、猕猴周围神经缺损的动物实验研究,探索出组织工程化人工神经的构建方法,开发出一种可供临床使用的组织工程化周围神经移植体,并进行市场研发。方法以大鼠和猕猴为实验动物,运用细胞学、组织学、生理学、行为学的实验技术和方法,完成以许旺细胞和骨髓基质干细胞为种子细胞的体外分离、培养、扩增、鉴定和种植;逐步解决支架材料的生物相容性、粘附性、降解性,空间结构的构建等问题;用组织工程学原理构建组织工程化周围神经移植体修复大鼠、猕猴周围神经缺损,研究其在神经修复和再生中的作用,通过与自体神经移植对照,评价组织工程化周围神经移植体修复周围神经缺损的疗效。结果(1)分步酶消化法和差速消化纯化传代的方法,可获得纯度达92%以上的许旺细胞(SC);密度梯度离心和差速消化纯化传代的方法,可获得均一性达95%以上的骨髓基质干细胞(BMSCs);BMSCs比SC体外分离培养容易且具有更强的增殖能力;多种细胞因子体外联合诱导,可使骨髓基质干细胞定向向许旺细胞分化,诱导率达60%以上。(2)体外、体内的实验研究显示,PLGA在生物相容性、粘附性、降解性,空间结构的构建方面优于PLA、PGA、壳聚糖和胶原等:单细胞凝胶电泳测定方法证明PLGA对许旺细胞无毒性,SC在经ECM凝胶表面修饰的PLGA支架上粘附及迁移得更好,模拟微重力条件下SC的利用率更高,细胞在PLGA支架表面的分布更均匀;化学萃取的方法可获得有良好的空间结构和力学性能、低免疫原性、可进行同种异体和异种移植的去细胞神经支架。(3)自体SC可在化学萃取后的异体去细胞神经桥接物中良好的生长、增殖、迁移;自体SC植入异体去细胞神经桥接物修复神经缺损,有利于早期轴突再生和再生轴突数量的增加及神经功能的恢复。(4)体外培养的BMSCs经诱导分化后,类似SC,亦能在经.ECM凝胶表面修饰的PLGA支架上粘附及迁移;用诱导分化后的自体BMSCs和ECM凝胶、PLGA纤维、PLGA中空管构建的组织工程化神经移植体,修复坐骨神经缺损,有利于轴突再生和神经功能的恢复,其效果接进自体神经移植。结论自体SC和BMSCs均能用作组织工程化人工神经的种子细胞,而BMSCs比SC体外分离培养容易且具有更强的增殖能力;PLGA和化学萃取的异体去细胞神经支架是较好的组织工程化周围神经移植体支架材料,化学萃取的异体去细胞神经支架具有更好的空间结构;用组织工程学原理构建的组织工程化周围神经移植体修复神经缺损,有利于轴突再生和神经功能的恢复,其效果接近自体神经移植。

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