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野生型PCDNA3.1(+)-CYP19基因表达质粒构建

邵喜英  曹江  苏丹  牟翰舟  王晓稼  
【摘要】:目的:构建野生型 PCDNA3.1(+)-CYP19基因表达质粒,为进一步构建 PCDNA3.1(+) -CYP19~(W39R)重组质粒,研究 CYP19~(W39R)生物学特性奠定基础,进而为临床内分泌治疗的个体化提供理论依据。方法:①pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)质粒构建:以胎盘组织(CYP19基因表达最高)总 RNA 为模板,用 RT-PCR 方法扩增1631bp、917bp、332bp 大小 CYP19基因片段, 分别 T-A 克隆连接到 pGEM-T Easy 载体上,经测序验证。第一、通过 Xhol Ⅰ内切酶和 Sal Ⅰ内切酶酶切 pGEM-T Easy-CYP19(1631bp)质粒和 pGEM-T Easy-CYP19(332bp)质粒,回收4229bp、 359bp 基因片段连接,构建 pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)质粒,经 EcoR Ⅰ内切酶酶切鉴定。第二、用 BamH Ⅰ内切酶和 Sal Ⅰ内切酶酶切 pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)重组质粒和 pGEM-T Easy-CYP19(917bp)质粒,回收945bp 和3633bp 基因片段连接,经 EcoR Ⅰ内切酶酶切鉴定, 得到290bp、1292bp、2997bp 条带,提示 pGEM-TEasy-CYP19(1563bp)构建成功。②pcDNA3.1 (+)-CYP19(1563bp)真核表达载体构建:用 Not Ⅰ内切酶分别酶切 pGEM-T Easy-CYP19 (1563bp)质粒和 pcDNA3.1(+)载体,pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)质粒得到1597bp、2981bp 大小电泳条带,pcDNA3.1(+)质粒得到5428bp 条带,切胶回收1597bp、5428bp 条带连接。结果:经 BamH Ⅰ内切酶(位于 pcDNA3.1(+)载体上距 Not Ⅰ 50bp 和 CYP19基因片段653bp 处)酶切鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳,得到两条716bp、6309bp 条带,提示 pcDNA3.1(+)-CYP19 (1563bp)真核表达载体构建成功,进一步用于构建 PCDNA3.1(+)-CYP19~(W39R)重组质粒。结论:野生型 pcDNA3.1(+)-CYP19基因真核表达质粒的构建,为进一步构建 PCDNA3.1(+) -CYP19~(W39R)重组质粒,研究 CYP19~(W39R)生物学特性奠定了基础,进而为临床内分泌治疗的个体化提供理论依据。

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