SSH法检测结直肠正常粘膜、腺瘤与腺癌中差异表达的基因

【摘要】：目的:结直肠癌的发生、发展是一个复杂的多步骤过程,涉及到多个癌基因的激活与抑癌基因的失活。然而现有的基因已无法充分解释这一过程。本实验的目的就是运用一种新型的差减杂交方法寻找结直肠癌恶性转化过程中新的相关基因,探索新的发病机制, 并为早期诊治提供分子基础。方法:分别获取同一患者结直肠远端粘膜、腺瘤和腺癌的 cDNA,运用抑制性差减杂交方法(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)筛选差异表达的基因,并构建三个相应的差减文库,即以腺瘤为检测 cDNA、远端粘膜为驱赶 cDNA 的差减 A -N 文库;以腺癌为检测 cDNA、远端粘膜为驱赶 cDNA 的差减 T-N 文库和以腺瘤为驱赶 cDNA 的差减 T-A 文库。将文库进行差减效率分析后,T-A 克隆,并对克隆进行 PCR 扩增和双向杂交筛选。选取部分阳性克隆测序,与 Gene Bank 同源比较,Virtual Northern Blot 验证差异表达的基因。结果:在差减 A-N,T-A 和 T-N 文库中分别筛选到4×10~2,3×10~2和3.5×10~2个克隆,片段长度在0.2-1Kb 间。差减效率分析表明非差异表达基因已被有效消减;正向差减和反向差减 cDNA 文库探针双向杂交筛选文库克隆,筛选到的克隆阳性率为 90%;测序验证,多数克隆仅被筛选1-2次;同源查寻表明部分为未知序列,可能为新基因,而大部分已知基因均已报道与肿瘤发生密切相关;Virtual Northern Blot 表明部分克隆在相应组织中的差异表达。结论:通过 SSH 法建立了三个差减杂交文库,所有结果均证实了这一方法的敏感、有效,是较为理想的差减方法。已经验证的差异表达片段的多样性和未知基因的存在证明了肿瘤发生、发展机制的复杂性,表明对肿瘤相关基因进行综合分析的必要性,提出肿瘤发生中分子间相互作用模块的存在及意义。对已知基因的深入分析和对未知基因的探索正在进行中。