啤酒中手性D-氨基酸诱导形成高尿酸血症的分子机理研究

【摘要】：高尿酸血症与日常饮食习惯密切相关,食用啤酒或与海鲜共食易诱发高尿酸血症,其致病机理有待进一步理解。本工作测定了燕京、青岛和哈尔滨啤酒中的D-氨基酸(DAA)量,并探讨了啤酒中DAA对高尿酸血症的影响。结果表明:二价铁离子(Fe~(2+))存在时,D-氨基酸氧化酶(DAAO)可催化氧化DAA产生高活性的羟基自由基(·OH),·OH损伤DNA,酶作用下产生尿酸。啤酒中DAA代谢产生的·OH如全部用来损伤核酸,每升燕京、青岛和哈尔滨可使血液中尿酸浓度分别增加2.24 mg/dL、0.95 mg/dL和0.81 mg/dL(血液中尿酸溶解度为7 mg/dL)。研究也表明,啤酒和海鲜中的维生素、碘离子(Ⅰ~-)和金属离子等均可不同程度地促进DAA损伤DNA产生尿酸。因此,饮用啤酒能诱发高尿酸血症,当其与海鲜组合食用时则更易诱发。1.引言高血压、心血管疾病、肾功能障碍等疾病与高尿酸血症密切相关~1。人体正常情况下,核蛋白和核酸代谢稳定,维持体内尿酸平衡。但因遗传或生活方式等因素导致血清尿酸浓度较高从而诱导产生高尿酸血症~2,流行病学研究表明高尿酸血症与多种食物(啤酒,海鲜,肉和果糖)有关~3,Choi等人调查研究表明血清中尿酸含量与啤酒饮用量呈正相关性~4,并且生活经验证明啤酒和海鲜同时食用会进一步提高高尿酸血症的发病率~5。目前其原因被理解为,啤酒和海鲜属高富含嘌呤食品。但Yamakita和Zgaga等人研究表明,高富含嘌呤的蔬菜(如蘑菇、菠菜、花菜、芦笋、黑木耳)及豆制品对痛风病人具有保护作用~(6,7)。可见食用高富含嘌呤物质将诱发痛风的原因需进一步探讨。众所周知,啤酒被称为液体面包,其中含有丰富的氨基酸及其它营养成分,氨基酸分为两种构型L-氨基酸(LAA)和D-氨基酸(DAA)~8,同样海鲜(鱼虾等海产品)也具有较高的营养价值。本论文以啤酒中所含DAA和海鲜中相关成分为研究核心,探讨啤酒、海鲜与尿酸形成的分子机制。2.实验部分2.1主要试剂D、L-Ala,D、L-Ser,D、L-Cys,D、L-Asn,D、L-Phe,D、L-Leu,D、L-His,D、L-Thr,D、L-Pro和腺嘌呤核苷脱氨酶(ADA)、异硫氰酸苯酯(PITC)购自JK。猪肾D-氨基酸氧化酶(pkDAAO),嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)和辣根过氧化物酶(POD)购自SigmaAldrich。小牛胸腺DNA、黄嘌呤氧化酶(XOD)和过氧化氢酶(CAT)购自Solarbio。燕京啤酒(YANJING),青岛啤酒(TSINGTAO),哈尔滨啤酒(HARBIN)(样品均在保质期内)购自超市。2.2 D-氨基酸诱导产生尿酸效应取不同量D-Ala、pKDAAO、Fe~(2+)加入到小牛胸腺DNA溶液中,溶液最终含DNA(50μg/ml),Fe~(2+)(0.1 mM)和不同浓度的D-Ala、pkDAAO,37℃水浴30 min,CAT除H_2O_2,加入PNPase、ADA、XOD,37℃水浴30 min,酶试剂与UV测定样品尿酸含量~9。2.3啤酒中D-氨基酸的测定取燕京、青岛和哈尔滨啤酒各50μl,用旋转蒸发仪将样品蒸干并(除乙醇)溶于100μl水,pkDAAO加入至上述溶液中(以不加pkDAAO样品为对照),37℃水浴30 min,同上方法再次将样品蒸干后PITC衍生化~(10)。HPLC对氨基酸衍生物测定。2.4海鲜中高富含的Ⅰ~-对DAA诱导尿酸形成的促进效应海鲜食品富含的Ⅰ~-可高达0.1 mmol/kg~(11),取不同量KI、EDTA-Fe~(3+)、D-Ala和pkDAAO加入到PBS溶液中,溶液最终含EDTA-Fe~(3+)(0.1 mM)、KI(0.1 mM)和不同浓度D-Ala。HPLC测定样品中·OH~(12)。考察Ⅰ~-是否诱导Fe~(3+)转化Fe~(2+)并诱导损伤DNA。3结果与讨论3.1 DAA诱导形成尿酸效应酶试剂与UV测定样品尿酸含量如图1。图1中A_(512)随D-Ala浓度增加而增大,1,2,3,4,5的A_(512)依次为0.178、0.246、0.276、0.313、0.348,即尿酸含量依次为0μM、9μM、40μM、69μM、87μM,其含量随D-Ala浓度的增加而增大。可见Fe~(2+)存在时,pkDAAO催化氧化DAA产生了·OH,·OH损伤DNA诱导产生尿酸。而pKDAAO对L-氨基酸无催化氧化作用,即Fe~(2+)和pKDAAO存在下,L-氨基酸不能够损伤DNA诱导尿酸形成。图1.DAA诱导尿酸形成结果图:1-5中D-Ala浓度依次为1:0mM;2:0.5mM;3:1.0mM;4:1.5mM;5:2.0 mM3.2啤酒中氨基酸测定HPLC对氨基酸PITC衍生物的标准样品和啤酒样品衍生物测定,结果如图2。图2A、B可知,HPLC能够有效的分离Cys、Asn、Phe、His、Thr、Ala、Pro和Arg。啤酒实际样品测定结果如图C。HPLC依次对燕京、青岛和哈尔滨啤酒测定,实验重复3次。测量结果的相对标准偏差均在7%以内,结果表明燕京、青岛和哈尔滨啤酒中含有相对较高含量的DAA,DAA总浓度为0.80 mM(燕京啤酒),0.34 mM(青岛啤酒),0.29 mM(哈尔滨啤酒)。若DAA被pkDAAO催化氧化产生的·OH全部用来损伤DNA,按人均血液体积60 dL计算~(12),1 L燕京、青岛和哈尔滨啤酒中DAA含量,可使血液中尿酸量各增加2.24mg/dL、0.95 mg/dL和0.81 mg/dL。处于痛风发病率边缘的患者血液尿酸将浓度增加32.00%、13.57%和11.57%。3.3海鲜中成分对DAA诱导尿酸形成的促进效应实验考察了Ⅰ~-存在时对DAA诱导DNA损伤效应的影响。图3中条带1-5的损伤程度依次为33.3%、33.4%、33.4%、33.5%和33.6%,条带6和7未损伤。即Ⅰ~-可将Fe~(3+)还原为Fe~(2+),Fe~(2+)进一步与pkDAAO催化氧化DAA产生的H_2O_2反应形成·OH,·OH损伤溶液中DNA。可见海鲜中的Ⅰ~-可以增加体内的氧化压力,促进DAA诱导DNA损伤。本课题组最近的工作还表明,海鲜中含相对较高含量的Fe~(3+)(364~1388μg/g)和Cu~(2+)(17.1~143.9μg/g)~(13),以及啤酒中Vc(维生素C)、V_E(维生素E)含量最高可达到30 mg/L和3 mg/L~(14)。Ⅰ~-能将Cu~(2+)还原为Cu~+,V_E能够将Fe~(3+)还原为Fe~(2+)。并且,维生素B可直接激活DAAO酶的活性等。它们均可促进DAA诱导DNA损伤产生尿酸。相关更多的实验发现正进行中。结论:啤酒中DAA被DAAO催化氧化的产物H_2O_2可与体内Fe~(2+)反应产生·OH,·OH损伤核酸并形成尿酸。啤酒中DAA代谢是尿酸形成的一种重要途径,而海鲜中的相关有效成分可促进尿酸的形成,食用高富含嘌呤食品仅是形成尿酸症的必要条件而不是真正原因。这意味着含DAA的食品均可能对尿酸形成引起高尿酸血症存在潜在的重要贡献,值得注意。