Rv0341用于诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病的研究概况

【摘要】：1990年日本Nakamura等报道了1例依赖利福平的结核分枝杆菌(依R菌)感染病例。1999年我国耐药结核学术研讨会上首次提出结核分枝杆菌依赖利福平生长的现象。方法对依R菌的研究中发现,有R和无R两种生长条件下,其形态、结构、染色性、毒力和蛋白质等方面均有明显差异。依R菌在有R管中菌落粗大、凸起、花菜样、易刮取和乳化;在光镜下菌体粗大、深染;在透射电镜下菌体细胞壁完整。而在无R管中菌落细小、扁平、荷包蛋样、不易刮取和乳化;在光镜下菌体细小、浅染且大小不等;在透射电镜下菌体细胞壁缺陷。提示依R菌在无R条件下可呈细胞L型样改变。感染依R菌的肺结核病患者表现为病灶范围广、症状重、体征明显、病程长。比较依R菌在两种生长条件下的蛋白图谱,发现84%的依R菌在含R管中假设蛋白Rv0341的表达量明显增加;86%的非依R菌和标准株H_(37)Rv在含R管和无R对照管均没有Rv0341的高表达。结果利福平对Rv0341在依R菌中的表达有上调作用;Rv0341的高表达与依R菌结核病密切相关,可视为依R菌的相关蛋白或标志物。本研究用大肠杆菌做为阴性对照,利用聚合酶链式反应自依赖利福平(14株)、耐利福平(23株)、利福平敏感(12株)的结核分枝杆菌、H_(37)Rv及卡介苗(共51株)中扩增编码假设蛋白Rv0341的iniB基因,经ApaⅠ和EcoRⅤ、KpnⅠ和SmaⅠ两组双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳检测其带型,进行限制性片段长度多态性分析。结果显示:iniB在不同类型的结核分枝杆菌中是相对保守的,测序结果也证实了不同类型结核分枝杆菌的iniB基因无突变。研究还采用基因重组技术克隆并表达iniB基因,经镍离子亲和层析柱纯化得到纯度约98%的重组蛋白Rv0341,并分别把依R菌高表达的蛋白Rv0341 (天然蛋白Rv0341)、重组蛋白Rv0341和无关蛋白EspA-IL-24按常规进行SDS-PAGE,转移至NC膜后用1%BSA封闭并分别以临床依R菌肺结核患者和非依R菌肺结核患者的血清为一抗,HRP标记的羊抗人IgG为二抗进行Western blot,鉴定蛋白的反应原性及特异性。结果显示:天然蛋白Rv0341和重组蛋白Rv0341与依R菌肺结核患者血清反应均出现明显的棕黄色条带,呈强阳性反应;与非依R菌肺结核患者血清反应无棕黄色条带,呈阴性反应;而无关蛋白EspA-IL-24与依R菌肺结核患者、非依R菌肺结核患者血清反应均无棕黄色条带出现,呈阴性反应。结论重组蛋白Rv0341具有良好的反应原性及特异性,其编码基因亦相对保守,可用于依R菌结核病临床血清学快速诊断试剂盒的研发。