【摘要】：野生动物是自然生态环境的重要组成部分,保护野生动物尤其是拯救濒危野生动物,对维持地球生态平衡和保持生物多样性具有重要意义。圈养人工繁殖, 是移地保护濒危动物,增加动物种群数量的重要手段之一。但在圈养条件下,多数濒危动物繁殖率都较低,严重阻碍移地保护的进程。特别是大熊猫,其生殖能力和育幼能力高度特化,生殖率和幼仔存活率低已成为目前圈养繁殖面临的两大急待解决的问题。研究表明生殖率低与生殖轴系中的各种激素内分泌失调,尤其是促性腺激素(FSH和LH)分泌不足有关。幼仔存活率低则与出生幼仔先天发育不全,免疫系统发育尚不完善相关。至今关于大熊猫生殖力和幼仔存活率低的分子基础仍不清楚。因此,本研究针对以大熊猫为主的濒危动物繁殖率低的两大主要问题,以大熊猫、小熊猫和东北虎为研究对象,开展了在动物生长发育和生殖过程中发挥重要作用的促性腺激素(FSH/LH)、生长激素及其受体(GH/GHR)的基因克隆、序列分析和表达研究,并探讨了今后生物工程生产大熊猫等濒危动物FSH/LH和GH用于人工繁殖实践的意义和可能性。主要结果如下: 1.利用RT-PCR技术从垂体组织扩增出大熊猫促性腺激素α、FSH β和LH β亚基编码区序列,它们分别编码120、129和141氨基酸的前体蛋白质,预测的分子量分别为13.6kD,14.6kD和15kD。同源性分析表明三个亚基的核苷酸和氨基酸序列与已报道的人、猪、牛、鼠和羊的序列高度同源(74%)。对位比较发现大熊猫序列也具有明显的氨基酸特异性,这些氨基酸是否会影响大熊猫FSH及LH的分子构型进而影响其功能、或最终引起大熊猫促性腺激素的分泌障碍则有待进一步的研究。2.将构建的真核表达载体pcDNA/α分别与pcDNA/FSHβ和pcDNA/LHβ共转染COS7细胞,进行瞬时表达。RT-PCR检测,表明三个亚基基因在COS7细胞中得到正常转录。体外生物学活性分析表明,表达的FSH和LH的培养液能有效刺激大鼠睾丸Sertoli和L,eydig’s细胞产生雌二醇和睾酮,证实COS7表达的FSH和LH已被正确地装配和糖基化修饰,能从COS7细胞有效分泌,且具有天然FSH和LH相似的生物学活性。此结果为将来利用CHO细胞稳定表达获得大熊猫重组FSH和LH,并将它们应用于大熊猫人工繁殖的深入研究奠定基础。3.构建大熊猫α,FSHβ和LHβ亚基基因的原核表达载体pGEX-pGEX-FSH 和pGEX-LH , IPTG诱导后在BL21宿主菌中得到高效融合表达,表达的融合蛋白GST- GST-FSH和GST-LH 的分子量分别约为36kD、38kD和41kD,并以不溶的包涵体形式存在于细胞中。无法直接用谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析柱纯化。为了在变性条件下亲和层析纯化表达蛋白,本试验分别8M 尿素和0.1M NaOH为溶剂,对溶解融合蛋白的条件进行了优化。结果发现尿素溶解的融合蛋白不能进一步纯化,而0.1M NaOH溶解的蛋白能得到一定程度的纯化。表明经0.1M NaOH溶解的融合蛋白能重折叠,从而能与层析柱上琼脂糖树脂结合而得到纯化,为进一步研究打下基础。4.克隆并测序小熊猫α和LHβ亚基的编码区序列,相似于大熊猫序列,它们也编码120和141个氨基酸的前体蛋白,预测的分子量分别为13.5kD和15.1kD, 两种动物LH序列的同源性达到95%以上。根据小熊猫、大熊猫与其它10种代表性哺乳动物的序列构建的分子进化树,与传统的物种分类地位基本吻合; 但α亚基基因分析表明,小熊猫和后兽亚纲分枝具有基因同源性与物种分类地位极不相符现象,推测哺乳动物尤其是后兽亚纲有袋类α亚基的进化速度十分缓慢,其序列可能与哺乳动物的祖先α亚基基因非常接近。本试验绘制的进化树也不支持“小熊猫与大熊猫归于同一科”的观点,从而为解决大、小熊猫的分类地位问题提供了又一分子生物学依据。5.与多数哺乳类动物相似,克隆的东北虎α、FSHβ亚基的开放阅读框为363bp 和393bp,编码120和129个氨基酸的蛋白,分子量为13.5kD和14.7 kD。但LH β亚基序列具明显特异性,编码142个氨基酸的前体蛋白,在信号肽部分比其它物种多一个Leu,其预测分子量为15.1 kD。在核苷酸和氨基酸水平, 东北虎三个亚基序列与其它物种相应序列也具有较高的同源性(64.7-96.6 %)。6.FSH和LH在畜牧业生产中被广泛用于促发情和排卵,目前已在大熊猫、东北虎等濒危动物人工繁殖中得到试用,但是效果普遍较差,其原因不甚清楚, 可能与所用异源激素的异质性有关,使用高同源性激素可能会产生更好的效果。本试验比较了克隆的大熊猫、东北虎及小熊猫FSH或LH亚基与人、鼠、羊、牛和猪哺乳动物相应序列,发现三个物种序列都与猪的序列具有最高的同源性,提示猪促性腺激素可能是大熊猫、东北虎和小熊猫人工繁殖研究应用中外源性异种激素的最佳选择。7.克隆和分析了进化上较保守,并在生长发育、生殖和免疫调节中发挥重要作用的大熊猫GH(AmGH)和GHR(AmGHR)基因。结果显示,AmGH cDNA编码26氨基酸的信号肽和190氨基酸的成熟肽。AmGHR则编码638氨基酸的前体蛋白, 由18氨基酸信号肽和620氨基酸成熟肽组成。同源性比较发现,大熊猫GH 和GHR的核苷酸和氨基酸序列,与已报道哺乳动物相应序列十分保守,尤其是GH成熟肽氨基酸序列与祖先GH序列及为相似,只有两个氨基酸的差异, 表明大熊猫GH与其它多数哺乳动物GH一样具有十分缓慢的进化率。8.以pGEX-4T-1为表达载体,在大肠杆菌BL21中通过与GST融合的方式高效表达了大熊猫GH。可溶性分析表明表达的融合蛋白(GST-AmGH)以不溶的包涵体形式存在,采用0.1M NaOH溶解包涵体,得到的蛋白与谷胱甘肽琼脂糖树脂具有较高亲和力,能通过亲和层析方便地纯化出的GST-AmGH,为将来用凝血酶切割得到有生物活性的大熊猫重组GH用于提高幼仔免疫力的研究奠定基础。