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何首乌致特异质肝损伤炎症动物模型的建立及肝脏毒性研究探讨

王全军  樊星  王伽伯  丁日高  肖小河  
【摘要】:药物性肝损伤已成为药品因安全性问题撤市的最常见原因之一。在我国,中草药所致的肝损伤已经超过抗结核药,成为药物性肝损伤最主要诱因。其特征表现为病死率高、危害大,难以早期发现。近年来国内外关于何首乌引起肝损伤的临床报道屡见不鲜,即便从保护传统医学的角度,CFDA也已从2013年10月首次发布关于修订含何首乌口服制剂的说明书的通知,发展至2014年7月明确的提示关注口服何首乌药肝风险。何首乌致药物性肝损伤机制并未明确,且化学成分复杂,无疑加大了研究难度。在我国与临床何首乌致人肝损伤相比,传统何首乌致动物肝损伤模型造模给药剂量为临床拟用剂量200倍且时间长,多为1-3个月,并不能真实模拟临床情况,因此,本研究旨在建立与临床特征更为接近的何首乌致大鼠肝损伤动物模型,研究何首乌醇提液对大鼠的急性毒性,以期为临床合理用药及监测提供试验依据,探讨TLR4与何首乌致肝损伤相关性并应用iTRAQ技术进行模型动物肝脏差异表达蛋白筛选,探究何首乌致肝损伤可能机制。观察潜在药物性肝损伤血清生物标志物microRNA-122在该模型中表达变化,为筛选潜在诊断生物标志物提供可能。材料与方法:1)预筛选何首乌致特异质肝损伤炎症动物模型激活剂。分别连续4天3.5%DSS动物自由饮用及单次给予脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)以期激活SD大鼠枯否细胞,然后给予大鼠何首乌醇提液连续7天,麻醉后采血并活检,用以筛选更有效模型激活剂。2)LPS激活后给予动物何首乌醇提液进行急性毒性实验,按照改良寇氏法测定何首乌醇提液对SD大鼠口服半数致死量(LD50)、最大耐受量(MTD)和最大给药量(MLD)。正式试验设计5个剂量组,分别为30g/kg、39g/kg、51 g/kg、69g/kg、90g/kg(r=1.32)及空白对照组,60只大鼠随机分6组,每组10只,雌雄各半。尾静脉注射给予各组大鼠4mg/kg LPS 2小时后,单次灌胃给予何首乌体积剂量依次分别为10ml/kg、13ml/kg、17ml/kg、23ml/kg、30ml/kg,连续观察14天,观察其急性毒性症状谱,记录累积死亡数及大鼠体重变化。3)经LPS激活后建立何首乌致肝损伤动物模型。将雄性SD大鼠按如下分为8组:空白对照组(Ctrl),LPS组(DSS),对乙酰氨基酚组(APAP),LPS+对乙酰氨基酚组(LPS+APAP),何首乌低剂量组(PMT-L),何首乌高剂量组(PMT-H),LPS+何首乌低剂量组(LPS+PMT-L),LPS+何首乌高剂量组(LPS+PMT-H)。按动物体重,尾静脉注射给予LPS组、LPS+APAP组、LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组4mg/kg LPS。2小时后,按组别分别灌胃给予对APAP组、LPS+APAP组大鼠312mg/kg对乙酰氨基酚,PMT-L组及LPS+PMT-L组3g/kg(相当于临床给药剂量的15倍)何首乌,PMT-H组、及LPS+PMT-H大鼠6g/kg(相当于临床给药剂量的30倍)何首乌,每日一次,连续给药7天建立特异质肝损伤炎症模型。在建模过程中,取第2小时、14小时、5天、8天四个不同时间点,分别对各组别动物麻醉后采血及取肝脏待测。以组织病理学检查和血液生化检查等指标判定模型是否建立成功。4)对模型动物肝脏组织中mTLR4表达水平进行测定,判定模型建立成功可能机制与TLR4相关性。5)同时,检测血清microRNA-122表达水平,按组别计算出各组各时间点相对值。并与四个时间点,各组血清ALT、ALP变化相对值及肝脏mTLR4表达相对值进行比较。判定其作为潜在何首乌致肝损伤的可能性,对其稳定性及灵敏性进行比较。6)应用iTRAQ技术对肝脏样本中高丰度差异表达蛋白进行筛选,以期探究该模型相关机制及通路。结果:何首乌致肝损伤炎症动物模型的建立,其可能机制探究及潜在生物标志物microRNA-122的验证。1)前期模型筛选,我们分别用3.5%DSS与4mg/kg LPS作为激活剂,与DSS组相比,给予SD大鼠20倍临床剂量何首乌后7天,可见LPS组动物全部出现溏便,眼睑分泌异常,脏器系数增加显著,ALT显著升高,组织病理学观察可见枯否细胞激活,伴有少量肝细胞变性,且肝损伤率高于DSS组。此外雄性较雌性对何首乌诱导大鼠肝损伤敏感。2)因此以LPS为激活剂,给予何首乌可见大鼠出现主要毒性症状为腹泻、眼渍,怠动,毛色不滑,随着药物剂量的增大,症状有所加重。依次根据给药剂量大鼠死亡情况为雄性1,0,2,3,5只,雌性1,0,4,4,5只,在给药后2-3天大鼠较空白对照组体重有所下降,14天后给药组大鼠肝脏系数没有明显变化,血液生化检测发现,给药组相对空白对照组转氨酶(ALT、ALP)没有显著性增加。其MTD为30g/kg、MLD为90g/kg、LD50为53.26g/kg,分别相当于临床拟用剂量的150、450和266.3倍,LD50的95%可信限为46.91~60.46g/kg。3)经单次LPS激活后,随着何首乌给药次数增加,LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组大鼠体重减轻。第8天,病理大体检查发现LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组大鼠肝脏轻微肿胀。肝脏组织病理学观察可见LPS+PMT-H组显著肝细胞变性、局部慢性炎性灶且肝损伤程度较LPS+PMT-L组严重,PMT-L组及PMT-H组仅见极少量肝细胞变性。APAP组可见肝细胞坏死。而LPS组肝细胞结构恢复正常。LPS+PMT-L和LPS+PMT-H组可见显著肝细胞变性、局部慢性炎性灶,何首乌给药浓度与肝损伤程度正相关。即何首乌致大鼠肝损伤炎症模型建立成功。4)应用RT-PCR技术对肝脏mTLR4表达水平检测发现,LPS组升高后恢复正常,而经诱导的LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组显著升高,与肝损伤程度正相关。应用iTRAQ技术对模型动物肝脏进行差异表达蛋白筛选,发现gi|13242301|ref|NP 077367.1|该模型差异表达蛋白,其对应基因为estradiol 17-beta-dehydrogenase 2,对应人源蛋白为HSD17B2。5)第2小时,与空白对照组相比,尾静脉注射LPS 2小时后,LPS组大鼠血清ALT/ALP,microRNA-122表达量显著升高(p0.05)。第14小时、第5天、第8天,LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组大鼠血清ALT/ALP改变未超过正常值范围。LPS组与Ctrl组大鼠血清microRNA-122的表达未见显著差异,而在LPS+PMT-L组,LPS+PMT-H组,APAP,LPS+APAP组大鼠血清组microRNA-122显著性增加(P0.05)。此外,与Ctrl组相比,不同时间点各指标,如microRNA-122、mTLR4相对均值表达情况显示:第8天,与ALT/ALP相比,LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组大鼠血清中microRNA-122和肝脏中mTLR4表达显著上调,且LPS+PMT-L组和LPS+PMT-H组比PMT-L组和PMT-H组升高显著。结论:1)LPS激活枯否细胞可触发何首乌特异质肝毒性;2)新型何首乌致大鼠肝损伤模型已经成功建立,与目前常用何首乌致肝损伤动物模型相比,新模型与临床更为相近。3)新型何首乌致大鼠肝损伤的作用机制与肝脏mTLR4表达水平有关,且损伤程度与肝脏mTLR4的表达呈正相关。4)与传统血清肝脏生物标志物ALT/ALP相比,血清microRNA-122变化更灵敏,且表达稳定,可作为该模型潜在血清生物标志物。此外,肝脏mTLR4表达趋势和血清microRNA-122相似,这也提示mTLR4或许也可作为该模型的潜在的生物标志物。该模型对研究何首乌肝损伤机制及筛选预防及诊断潜在生物标志物具有重要意义。应用iTRAQ技术筛选该模型差异蛋白为gi|13242301|ref|NP_077367.1|,其对应基因为estradiol 17-beta-dehydrogenase 2,对应人源蛋白为HSD17B2。该蛋白作为潜在何首乌致肝损伤生物标志物较ALT/ALP、microRNA-122和mTLR4相比更灵敏和稳定。同时,该模型对可引起特异质肝损伤的化学药,植物性药材等的肝毒性的研究均有指导意义。

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