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CYP3A4基因沉默和高表达对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响

徐新云  毛侃琅  毛吉炎  
【摘要】:目的建立CYP3A4沉默细胞株和CYP3A4高表达细胞株,观察CYP3A4基因沉默和高表达对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响。方法根据GenBank提供的CYP3A4基因mRNA序列设计合成shRNA,将shRNA连接到质粒中,构建慢病毒载体,对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞,用嘌呤霉素筛选得到CYP3A4沉默细胞株。根据GenBank提供的CYP3A4基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒高表达载体,将慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞,筛选得到CYP3A4高表达细胞株。应用荧光定量PCR和Western blot对CYP3A4基因沉默和高表达细胞进行鉴定。用不同剂量TCE(0,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 mmol·L~(-1))对正常肝细胞、CYP3A4沉默细胞和CYP3A4高表达细胞染毒12 h,观察凋亡基因和癌基因表达变化。结果①基因测序证明插入载体的CYP3A4干扰序列与设计序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4沉默细胞CYP3A4基因表达比正常肝细胞下降77.3%,Western blot实验显示CYP3A4沉默细胞CYP3A4蛋白表达水平比正常肝细胞下降84.6%。CYP3A4沉默细胞经三氯乙烯染毒后Bcl-2表达水平显著高于L02肝细胞;胱天蛋白酶3表达水平无明显改变;胱天蛋白酶8仅在TCE高剂量组表达下降;胱天蛋白酶9在TCE≥1.0mmol·L~(-1)表达水平下降;癌基因c-fos,c-myc,k-ras和p53表达水平都有一定程度下降,部分剂量组存在显著差异(P0.05或P0.01)。②基因测序证明高表达载体CYP3A4基因序列与GenBank提供的CYP3A4序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4高表达细胞比正常肝细胞CYP3A4基因表达提高94倍,Western blot实验显示CYP3A4高表达细胞株CYP3A4蛋白表达比正常肝细胞升高136%。CYP3A4高表达细胞经TCE染毒后Bcl-2表达水平下降;凋亡基因胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9表达水平高于正常肝细胞。p53在CYP3A4高表达细胞中表达水平比正常肝细胞表达下降;c-fos,c-myc和k-ras基因表达都是CYP3A4高表达细胞显著高于正常肝细胞。结论沉默CYP3A4基因可使肝细胞中的凋亡基因和癌基因表达水平下降,而CYP3A4基因高表达可以促进凋亡基因和癌基因表达,提示CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在明显关系。

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