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广西眼镜蛇毒神经生长因子基因的构建及真核表达

石庆秋  宋慧  韦敏  班建东  舒雨雁  张学荣  
【摘要】:目的构建广西眼镜蛇毒神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因的真核表达载体pcDNA_(3.1)-NGF,并在哺乳动物细胞中进行表达和对表达产物进行鉴定及生物活性分析,为大量制备NGF和采用NGF基因治疗神经系统的疾病奠定了实验基础。方法用Trizol试剂从眼镜蛇毒腺中提取总RNA,采用RT-PCR的方法逆转录合成第一链cDNA,并根据眼镜蛇毒NGF的保守序列设计和合成上下游引物,进行PCR扩增:将目的基因、真核表达载体pcDNA_(3.1)分别经KpnⅠ和XhoⅠ单酶切,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和分别进行胶回收:将目的基因与载体连接后进行转化从而构建重组载体pcDNA_(3.1)-NGF,经酶切和测序对重组体进行鉴定。利用磷酸钙转染试剂盒转染.NIH3T3细胞,用G418筛选阳性克隆,对阳性克隆培养上清中NGF的表达用SDS-PAGE、Western-Blot的方法来检测,以PC12细胞的生长检测表达蛋白的生物活性。结果重组载体经酶切、测序等分析插入的基因片段为表达眼镜蛇毒NGF的基因,NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达,表达的目的蛋白能促进PC12细胞突起生长。结论成功构建了真核表达载体pcDNA_(3.1)-NGF,并检测出在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,且具有一定生物活性,为进一步开展NGF基因治疗神经系统的疾病奠定了实验基础。

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