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BmNPV的双基因干涉对病毒增殖的影响

潘敏慧  吕军  鲁成  
【摘要】:家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV)感染家蚕所引起的家蚕核型多角体病,是蚕业生产上最常见且危害最严重的蚕病之一。如何增强家蚕对该病毒的抗性和培育抗病品种一直是蚕业研究的热点。近年来,RNAi技术迅猛发展,已被广泛应用于基因功能鉴定、性状改良等研究当中。本研究将RNAi技术与转基因技术结合,研究BmNPV侵染、复制的关键基因对病毒增殖的影响。主要研究结果如下:1.以BmNPV早期表达因子ie2,晚期表达因子lef1,lef2,lef3,病毒囊膜蛋白gp64基因为抑制靶标,分别与BmNPV病毒的39k启动子,ie1启动子连接,构建了2个细胞水平的双基因转基因干涉载体(pBac[A3EGFP-39kpdsie2-39kpdsgp64afm],pBac[A3EGFP-39kpdslef3-39kpdsgp64afm],分别简称为:pBacA3EGFP-KEG,pBacA3EGFP-KFG)和3个家蚕个体水平的双基因转基因干涉载体(pBac[3xp3dsRed-39kpdsie2-39kpdsgp64afm],pBac[3xp3dsRed-39kpdslef3-39kpdsgp64afm],pBac[3xp3dsRed-ie1pdslef2-39kpdslef1afm],分别简称为:pBac3xp3dsRed-KEG,pBac3xp3dsRed–KFG,pBac3xp3dsRed–EF2KF1)。2.以瞬时转染的方式将所构建的细胞水平干扰载体转入家蚕胚胎细胞(BmE-SWU1),BmNPV攻毒后发现,靶基因dsRNA对BmNPV在细胞中的复制、增殖均起到一定的抑制作用。无论是感染率还是病毒多角体生成个数,转基因细胞均比非转基因细胞低。在病毒感染早期,载体pBacA3EGFP-KEG对病毒的抑制效果优于pBacA3EGFP-KFG,但是在病毒感染后期,结果相反。并且在转染了干涉载体的细胞中,病毒基因的表达量受到明显的抑制。3.以显微注射的方式将3个家蚕个体水平的双基因转基因干涉载体注射蚕卵,成功获得了具有潜在抗病性的转基因素材。通过反向PCR分析,在转基因系统中,外源DNA按照piggyBac特定的转座位点TTAA随机插入家蚕基因组。并且经过southern blot检测发现,转基因系大部分为单拷贝,只有pBac3xp3dsRed-KEG有2个拷贝。经BmNPV攻毒后调查期间死亡率发现,实验组与对照组相比,对病毒复制、增殖抵抗力明显增强。

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