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家蚕孵化酶样蛋白的表达、纯化与功能鉴定

唐顺明  卢福浩  沈兴家  王娜  丁丽平  赵巧玲  张国政  郭锡杰  
【摘要】:孵化酶是后生动物胚胎孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。前文我们报道了全长家蚕孵化酶样基因(BmHEL)(967bp)克隆及其转录特性,初步推定其参与了家蚕孵化行为。本文对该基因在原核表达系统表达、纯化及其对家蚕卵壳的降解功能进行了研究。以全长BmHELcDNA为模板,PCR方法分别获得了BmHELORF(885bp)、缺失信号肽(BmHELa,834bp)和推测成熟酶功能区(BmHELb,624bp)的3个基因片段,亚克隆入原核表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21中进行表达。外源蛋白以包涵体形式存在,获得产物含有6×His-Tag,其分子量分别为33.4kD,31.8kD和24.0kD。用Ni-NTA亲和层析柱法纯化获得目的蛋白,并以WesternBlot法鉴定确定。纯化复性后三种孵化酶对家蚕卵壳底物有一定降解活性,其中BmHEL的活性最高,BmHELb的活性最低。另外,pH7.1反应条件下三种酶的活性比pH9.5时高。本研究结果为进一步阐明家蚕的孵化分子机理和孵化酶在转基因领域中的应用奠定了基础。

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