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家蚕microRNAs的生物信息学预测及其表达特性分析

黄勇  唐顺明  王力刚  沈兴家  
【摘要】:MicroRNAs(miRNAs)是一类长约22个碱基的非编码RNA分子。它们通过与靶基因3′UTR区的结合来调控靶基因的表达,在生物的生长、发育、疾病和细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥着重要的作用。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目的一种重要模式生物,研究其miRNAs有助于阐明家蚕的生长发育调控规律,并为鳞翅目害虫防治研究提供借鉴。目前在Sanger数据库中得到证实的家蚕miRNAs只有55个,远远少于其它昆虫物种。为此,我们根据miRNAs具有一定的保守性的特点,利用生物信息学等方法对新的家蚕miRNAs分子进行了挖掘和验证。首先在家蚕基因组数据库(http://silkworm.genomics.org.cn/)下载整合的全基因组序列,在miRBas(ehttp://microrna.sanger.ac.uk/sequences/;Release13.0May2009)中下载动物成熟体miRNAs序列,用blast检索出已知的成熟体序列;对blast检索到的序列分别向前、向后各延伸200bp,并输出序列,用RNAfold软件对输出的序列进行折叠,如果二级结构中包含长度超过100的发夹序列、且成熟体位于发夹序列中,则该发夹序列作为候选前体。然后计算后选前体中的每种三联核苷酸含量,因为一共有64种三联核苷酸,所以每个前体可以计算出一个64维向量,利用支持向量机(Support Vector Machine)预测这个64维向量是否为miRNAs前体,保留概率大于0.5的候选前体;并计算这些候选前体的自由能指数(最小自由能/长度/GC含量),保留自由能指数大于0.8的候选前体。最后把得到的前体序列,通过在NCBI上(http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/index.html)进行Blast比对,删除表达蛋白的序列;将其余miRNAs候选分子与已知的家蚕miRNAs进行比较,最终得到10个新的家蚕miRNAs候选分子。设计特殊的茎环引物,对得到的10个miRNAs候选分子进行stem-loop RT-PCR验证。结果表明,其中1个miRNA在卵、幼虫和蛹期都无表达;其它9个miRNAs中,卵期3个有表达,幼虫期9个都表达,蛹期7个有表达。对9个有表达的miRNAs进行了克隆、测序,序列与预测结果完全一致,确定这9个为新的家蚕miRNAs。本研究结果为系统发掘和阐明家蚕miRNAs基因的功能及其在发育过程中的调控机制奠定了基础。

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