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microRNA靶向抑制RORa表达对DADS诱导人胃癌细胞增殖的影响

凌晖  文玲  曾铁兵  朱亚平  苏琦  
【摘要】:目的:观察RORαmiRNA干扰对DADS处理前后人胃癌细胞增殖的影响。探讨RORα在DADS抑制人胃癌细胞增殖中的作用,寻找DADS抑制人胃癌细胞的新靶点。方法:根据GenBank提供的RORα基因序列设计4条RNA干扰序列,命名为miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4,并设计1条非特异性序列作为阴性对照。合成各自的寡核苷酸链,退火后与miRNA表达载体pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR连接,转化扩增后测序,将含靶向RORα的microRNA(miRNA)的质粒pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFpmiR-RORα转染MGC803,SGC7901细胞,通过Western blot验证miRNA-RORα对RORα表达的抑制作用;MTT法检测,群体倍增时间和流式细胞术分析RORα表达下调对DADS抑制胃癌细胞增殖的影响。结果:重组pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR-RORα-miRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确,荧光显微镜下观察细胞转染效率,可清晰地看到细胞内的绿色荧光。Western blot结果显示,转染RORα-miRNA1-3组细胞的RORα蛋白表达明显低于转染negative-miRNA组和未转染组(P0.05)。MTT结果显示,RORα干扰细胞增殖率(光吸收值)高于未转染组和转染阴性组(P0.05)。并且,干扰RORα表达可削弱DADS对SGC7903,MGC803细胞的增殖抑制作用,干扰RORα后加DADS的细胞增殖率(光吸收值)明显高于DADS处理的未转染组和转染阴性组(P0.05)。DADS处理后的各组细胞,细胞群体倍增时间都增长,其中转染RORα-miR3组由处理前的15.50 h延长至处理后的17.27 h;但DADS对转染后的细胞增殖抑制作用弱于DADS处理未转染组(由21.86h延长至36.69h)与空载体转染组(由22.01h延长至36.03h)的抑制作用。这说明RORα基因沉默削弱了DADS的抑制增殖作用。流式结果表明,实验组G0/G1期细胞百分比明显低于对照组,而S期和G2M期细胞百分比则高于对照组,有统计学意义。实验组细胞增殖指数高于对照组。说明有促进增殖作用。结论:miR-RORα表达载体(pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα)转染细胞后可明显抑制RORα表达;干扰至RORα表达明显下调后,可促进SGC7903,MGC803细胞增殖,并且抑制RORα表达可削弱DADS对SGC7903,MGC803细胞的增殖抑制作用,说明RORα参与DADS抗SGC7903,MGC803细胞增殖的作用。

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