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带有负电荷的Hela细胞穿透肽内化机制及生物学功能的初步研究

刘芸  刘爱华  吴向玲  江力玮  罗海华  邓鹏  姜勇  
【摘要】:目的:细胞穿透肽是近年来发现的具有穿透哺乳动物生物膜功能,并能介导大分子物质跨膜转导的一类小分子肽段,大多含有较多的碱性氨基酸。生理状态下,穿透肽分子的正电荷残基可与细胞表面蛋白聚糖多糖链的负电荷发生作用,介导了穿透肽与细胞膜的结合。我们前期通过噬菌体筛选技术得到了多条Hela细胞穿透肽,其中高峰度的PP1分子带较多负电荷,等电点偏酸性,区别于大多数经典的穿透肽。本研究的目的在于研究该分子介导内化的能力和机制,并初步探讨其生物学功能及应用价值。方法:利用各种内化通路抑制剂,与经典的带有正电荷的穿透肽进行对照实验,比较二者内化表现的改变;构建并表达PP1分子与增强型绿色荧光蛋白、凋亡肽VP3的融合蛋白,观察融合蛋白的内化能力以及促进Hela细胞凋亡的效应。结果:与带有正电荷的穿透肽分子表现不同的是,分别在4℃和肝素处理条件下,PP1分子仍然能够发生有效地内化条件下。Clathin介导的内化途径抑制剂蔗糖、微管抑制剂nocodazole和脂筏结构抑制剂MβCD处理,可完全阻断PP1分子内化,而带有正电荷的穿透肽分子仅表现部分的抑制;PP1分子与增强型绿色荧光蛋白-凋亡肽VP3的融合蛋白可以有效地发生内化,经噻唑蓝法(MTT)检测Hela细胞的存活率仅为46%,与对照组比较发生明显的凋亡。结论:PP1的内化依赖于细胞内的Clathrin、Caveolae蛋白以及微管结构的完整,但是与细胞表面的负电荷分子以及能量关系不大;Hela细胞穿透肽与凋亡素融合蛋白表达成功,该蛋白具有很高的内化活性,并能有效促进Hela细胞凋亡。

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