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调控细胞外信号调节激酶-1对肝星状细胞功能的影响

王要军  谢渭芬  张新  
【摘要】:目的:探讨ERK-1基因静默能否下调HSC ERK-1的表达并影响HSC的生物学活性;以及ERK信号通路、瘦素与HSC生物学功能的关系。方法:①将筛选出的ERK-1 siRNA转染HSC-T6,用MTT法测定细胞增殖变化、RT-PCR法检测Ⅰ以及Ⅲ型胶原mRNA、TIMP-1 mRNA表达、ELISA法测定HSCⅢ型胶原分泌的变化、流式细胞术检测分析细胞增殖和凋亡等生物学特性的影响。②构建二甲基亚硝胺损伤肝纤维化大鼠模型,RT-PCR检测不同时期纤维化肝脏组织中瘦素mRNA变化;用免疫组化SABC法检测相应的纤维化肝组织中瘦素和Ⅰ、Ⅲ胶原的表达。③瘦素刺激HSC-T6后,Western blot法检测HSC ERK-1/2、pERK(磷酸化ERK)-1/2的变化,ELISA法测定HSC合成Ⅲ型胶原的含量。另外,先进行ERK-1 RNAi然后再加入瘦素刺激HSC-T6,观察ERK-1/2、pERK-1/2表达及HSCⅢ型胶原合成的变化。结果:①189 siRNA对ERK-1表达有较好的抑制效率,稳定性最好,并可持续72 h。②HSC转染ERK基因静默后第4 d始,细胞增殖明显慢于对照组(P0.05),作用可持续至第6 d。HSC-T6 G0/G1时相较对照组明显增高(58.74%±2.43%vs 51.04%±2.15%,P0.01),S期细胞数百分比明显低于对照组(30.58%±2.29%vs 38.13%±1.91%,P0.01)。HSC基因静默48 h、72 h,Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP-1 mRNA表达明显低于对照组(P0.01)。培养上清液中Ⅲ型胶原含量较对照组显著减少。③肝纤维化大鼠肝组织中瘦素及Ⅰ、Ⅲ型胶原在造模第1、2、3周表达逐渐增强,瘦素与Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈正相关。④通过测定HSC合成胶原含量,Western blot检测ERK-1/2、pERK-1/2表达,结果显示瘦素刺激可使HSC-T6 ERK-1/2、pERK-1/2表达和Ⅲ型胶原合成增加,ERK-1基因静默可对瘦素起抑制作用。结论:①针对大鼠ERK-1 mRNA化学合成的189 siRNA,对靶RNA有较好的基因沉默效率,最大作用时间在48 h,有效抑制时间达72 h。②siRNA沉默ERK-1可显著抑制HSC-T6活化、增殖、合成及分泌细胞外基质(extracellularmatrixc,ECM)。③在肝纤维化发生发展过程中,瘦素表达水平随肝纤维化程度加重而增加,且与Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平呈正相关,提示瘦素在肝纤维化进程中起重要作用。④瘦素可刺激HSC合成ECM,该作用可能通过ERK-1信号转导通路起作用;ERK-1 siRNA可特异性地阻断ERK-1信号转导通路从而减弱瘦素刺激HSC合成ECM的能力。⑤ERK-1可能成为治疗肝纤维化新的靶点。

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