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基因组分析指导的海洋链霉菌IMB3-202活性物质的发现

王冕  郝晓萌  胡媛媛  谭亿  王以光  甘茂罗  肖春玲  
【摘要】:当前,耐药细菌的快速传播,尤其是产KPC碳青酶烯酶和新德里金属-β-内酰胺酶(NMD)的多重耐药阴性菌的出现,使得临床上作为阴性菌"最后防线"的碳青霉烯类抗菌药物失去原有效力而对人类健康构成了严重的威胁~([1])。为应对细菌耐药问题,研发新型的抗耐药菌药物成为当务之急。放线菌是抗生素药物的重要来源。2000年以来,从海洋放线菌中发现的一系列高效、新颖的先导化合物,使海洋放线菌引起了广泛的关注~([2])。与此同时,基因组测序技术的迅速,使得微生物基因组大规模测序得以开展。根据Integrated Microbial Genomes在线数据库的数据,目前,已经公开的微生物基因组完成图达到6762个。对天蓝色链霉菌等模式放线菌基因组分析发现,其可能合成的产物比预计的要丰富的多,一种放线菌存在多达30-50种次级代谢生物合成基因~([3)]。此外,随着对天然产物生物合成机制的深入理解,从基因水平预测微生物产物结构成为可能。因此,基于基因组序列分析,挖掘并发现微生物中新的活性天然产物成为近年的研究热点~([4])。在从海洋放线菌筛选新抗生素的过程中,我们对黄海分离的放线菌发酵产物进行活性筛选,其中50株显示出铜绿假单胞菌抗菌活性,其中5株菌的发酵产物显示抗多重耐药摩氏摩根菌活性。为了解菌株的次级代谢潜能,我们对其中一株活性菌株—海洋链霉菌Streptomyces sp.IMB 3-202进行了基因组测序。利用AntiSMASH对基因组进行分析,发现20个潜在的次级代谢生物合成基因簇,其产物有铁载体、非核糖体肽(NPRS)、萜、氨基糖苷、聚酮(PKS)、吲哚等结构类型。其中,基因簇Cluster 8与星孢菌素(staurosporine)、蝴蝶霉素(rebeccamycin)、cladoniamide等吲哚类抗生素的生物合成基因显示出较高的同源性。因此,推测该菌株可能产生吲哚类抗生素。为促进该基因表达,我们设计了含有3%海盐和不含海盐两类共14种发酵培养基,通过LC-MS分析,发现部分发酵产物中显示有星孢菌素类成分。通过大量发酵和系统的分离纯化,从中分离得到4个化合物。利用UV、NMR、MS等波谱学方法鉴定这些化合物的结构分别为,星孢菌素(1)及其衍生物antibiotic RK286C(2)~([5])、holyrineA(3)和antibiotic K 252c(4)~([5])。体活性实验表明,星孢菌素对铜绿假单胞菌显示出一定的抗菌活性,MIC值为64-128μg·mL~(-1),同时也对金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌和白色念球菌具有较弱的抗菌活性,MIC值为128-256μg·mL~(-1)之间。利用MTT法测定化合物以人体外抗肿瘤细胞的活性,化合物1对骨肉瘤U2OS、宫颈癌Hela细胞、结直肠癌HCT116和乳腺癌MCF-7、肺癌H1460、肺腺癌细胞A549等肿瘤细胞显示出很强的抑制活性(IC50:0.63uM,0.0008uM,0.012uM,0.338uM,0.066uM,0.019uM),化合物2-4对宫颈癌Hela细胞、结直肠癌HCT116和乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞显示出很强的抑制活性,对宫颈癌Hela细胞(IC50:0.00075uM,0.09uM,2.11uM),结直肠癌HCT116(IC50:0.012uM,0.033uM,5.085uM),乳腺癌MCF-7(IC50:0.333uM,1.187uM,8.59uM)。

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