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海洋灰绿曲霉压力响应基因Agseb1的功能初步研究

吴媛  张元兴  蔡孟浩  
【摘要】:海洋灰绿曲霉HB1-19的无性发育及次级代谢产物合成都受到盐度的调控,在盐浓度增高的人工海水环境里,分生孢子形成能力和灰绿霉素A的合成能力都逐渐增强。可见与其他丝状真菌类似,海洋灰绿灰绿曲霉中环境信号响应、发育模式及次级代谢三者都相互关联且相互影响。在酿酒酵母中,压力响应基因msn2/4的编码蛋白可以特异识别并结合STRE序列,响应多重压力的诱导来调控不同类型的基因。因此,海洋灰绿曲霉中可能也存在类似的功能基因,其突变可能会改变菌株对环境压力的敏感性从而影响灰绿曲霉的无性发育,同时也会影响次级代谢的合成。为了验证推测,首先通过同源比对、简并PCR和Hi-Tail技术从海洋灰绿曲霉中克隆了msn2/4的同源基因Agseb1。Agseb1编码区全长1855 bp,在545-659 bp处有一个115 bp的内含子,氨基酸全长579 aa,与几种典型丝状真菌的同源性分别为:赤曲霉94%、米曲霉61%、黑曲霉60%、构巢曲霉55%。通过结构域分析可知,在第480-503aa和509-531aa处共有两个锌指结构域,且在丝状真菌中高度保守。此外,Agseb1与酿酒酵母Msn2p、Msn4p有59%和54%的同源性,而其锌指结构域同源性高达74%和62.5%。在此基础上,构建基因打靶质粒,利用同源双交换的方法构建了ΔAgseb1突变株,并从菌株的宏观及微观形态、产物合成、盐度胁迫下的发育情况三个方面对Agseb1基因的功能进行了初步分析。实验结果表明,ΔAgseb1菌株生长延滞,菌落变小、边缘菌丝短小紧凑,与野生株的边缘辐射状生长显著不同,同时缺失株菌丝生长过程中菌丝短小而形成更多分枝。缺失株菌落表面累积大量子囊果,野生型则生成大量分生孢子,表明缺失株改变了原有的无性发育模式而倾向有性发育。通过扫描电镜及透射电镜分析发现,缺失株分生孢子头出现生长缺陷,分子孢子易结成长串从孢子头上脱落,且细胞壁外围边缘顺滑,内容物密度较高。结果表明,Agseb1基因很可能参与了无性分生孢子发育的后期调控。同时,ΔAgseb1菌株中灰绿霉素A的产量显著下降,其对应的Agpks1基因转录水平下调。与野生株相比,无性发育中心途径的关键基因AgbrlA转录有所增强,可能与Agseb1缺失导致的解抑制作用有关。而abaA、wetA转录水平下降,与此相应地是缺失株菌落形成大量子囊果,整体无性发育程度减弱。此外,与野生株相比,缺失株对高渗环境的敏感性下降。这些结果表明,Agseb1基因不仅响应盐度压力,而且影响分生孢子的形成和灰绿霉素A的合成,它在海洋灰绿曲霉中可能参与了多条途径的调控。

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