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昆虫几丁质酶的分离纯化及其抑制剂筛选的研究

刘明艳  田玉敬  张洪斌  
【摘要】:几丁质酶是一类能把几丁质降解为N-乙酰-D-氨基葡萄糖或寡聚N-乙酰胺基葡萄糖的水解酶。该酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用,其本身及其酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。本研究对两种不同来源的昆虫—蚕蛹和棉铃虫体内的几丁质酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行比较,并以棉铃虫几丁质酶作为筛选靶标进行几丁质酶抑制剂的筛选。结果如下:本研究分别从蚕蛹和棉铃虫体内提取几丁质粗酶,经过硫酸铵分级沉淀和SephadexG-150分离得到几丁质酶,用SDS-PAGE测得分子量分别为88kDa、75kDa。水解胶体几丁质的Km值分别为22.3μmol/L、41.0μmol/L;最适反应温度分别为45℃和50℃;最适pH值均为6.0;金属离子和有机试剂对几丁质酶活性都有影响,其中较高浓度的Mn2+对两酶均有较强的激活作用,而Cu2+、SDS对两酶都有较强的抑制作用。两酶在30℃保温1h后活力没有明显的降低,温度高于55℃保温1h后两酶酶活力下降很快,表明该酶的在55℃以上的热稳定性差。其次本研究以棉铃虫几丁质酶作为筛选靶标进行几丁质酶抑制剂的筛选。为获得抑制效果好的菌株,本研究对全国各地采集的100份土样中的细菌、放线菌、真菌进行了选择性分离,为活性菌株的筛选建立了菌种库,为生物防治提供优秀的拮抗菌种资源;再通过平板透明圈法和DNS比色法筛选出以新1#菌株为代表的具有几丁质酶抑制性的活性菌株26株。新1#菌株发酵液通过无水乙醇分级醇沉、Sevage试剂除蛋白后,经SephadexG-100凝胶色谱柱多次分离后,HPLC检测显示一个保留时间在15min左右的物质单峰,DNS比色法验证其抑制率为54.2%,苯胺-二苯胺显色实验证明此物质具有还原性。本研究为基于几丁质酶阻断的生物农药筛选奠定了基础。

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