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L-α-甘油磷酸胆碱的制备及磷脂酶的筛选与酶学性质研究

朱丹峰  张洪斌  胡雪芹  
【摘要】:磷脂酰胆碱(PC)及其水解产物L-α-甘油磷酸胆碱(GPC)广泛应用于医药和保健品领域。以磷脂酰胆碱为基础的生物转化产物在医药、食品、化妆等行业有重要用途。磷脂酶A1(EC3.1.1.32)是一类催化磷脂sn-1位酰基水解的酶族,反应生成L-β溶血磷脂和脂肪酸(FA)。在磷脂酶A1的催化下,当底物为卵磷脂时,产物为L-β溶血磷脂酰胆碱和FA,在一定的反应体系和催化条件下LPC中sn-2位酰基会转移到sn-1位,再被该酶水解,生成GPC和脂肪酸。首先以底物PC为表面活性剂,正丁醇为助表面活性剂,异辛烷为油相,醋酸盐缓冲液为水相构建W/O型微乳体系,对酶法制备GPC的工艺进行了优化。最适温度55℃;最适pH4.0;Ca~(2+)对产物的产量没影响;补加底物前,酶与缓冲液的体积比为1:2;初始反应底物浓度为0.278g/mL,即此时初始反应体系变为:PC:异辛烷:正丁醇:水相=2:6.3:0.9:0.5;补加底物浓度为0.437g/mL;补加质量为初始质量的一半;补加底物的同时要补充适量水相缓冲液,缓冲液的量按PC:异辛烷:正丁醇:水相=1:2:0.286:0.25计算;补加时间为反应后1.5h;反应总时间为6h;实行补加工艺后,GPC产率增长到96.5%。采用将反应液先旋蒸后萃取的方法使反应试剂与萃取剂分离,分别回收。其中萃取剂二氯甲烷、甲醇/水可通过旋蒸回收,反应试剂异辛烷和正丁醇利用气相色谱外标定量法测出体积比,然后配成原比例7:1,重新用于下一批反应。在磷脂酶催化水解PC制备GPC的过程中,通过TLC法证实了反应过程中确有中间产物LPC的生成,通过酰基转移反应最终转化为GPC。另从土壤中分离筛选出一株磷脂酶A1产生菌B8,通过形态特征和18SrDNA序列分析鉴定为黑曲霉,利用硫酸铵盐析,Superdex G-100凝胶柱层析纯化酶蛋白,磷脂酶A1从粗酶液到最终纯化产物共纯化了45倍,回收率为23.28%,纯化后的酶比活力高达442.56U/nag。通过SDS-PAGE电泳分析该酶分子量约为40kDa。以大豆卵磷脂为底物,对该酶的酶学性质进行研究,酶促反应的最适温度为35℃,最适pH为6.0。该酶催化大豆卵磷脂的V_(max)为1.449mmol·L~(-1)·mg~(-1),K_m为13.59mg·mL~(-1)。在4℃保存8周该酶活力仍能保留82%。

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