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表达猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap蛋白CHO-K1稳转细胞系的建立

武乐祎  卞广林  吴素芳  车影  李鹏  任鹏举  王选年  
【摘要】:猪圆环病毒在我国广泛流行,给我国养猪业带了严重危害,Cap蛋白是PCV2唯一的结构蛋白,能诱导中和抗体的产生,因此被用于猪圆环病毒亚单位疫苗的研究。目的:建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHOK1悬浮稳转细胞系,表达Cap蛋白,为开发新型有效防治猪圆环病毒的疫苗奠定基础。方法:优化PCV2-Cap蛋白的基因序列,并在目的片段的N端连接一段信号肽序列,使目Cap蛋白能够分泌到胞外;将载体用Hind III和Eco RI双酶切后利用T4 DNA连接酶将目的片段与线性载体连接,构建表达PCV2-Cap蛋白的真核表达质粒p EE12.4-PCV2-Cap,利用脂质体转染的方法将重组质粒转入CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素和蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)加压筛选出能够在正常生长的细胞,7天后收集细胞,通过有限稀释的方法,将细胞转至96孔板,挑选出单个细胞的孔,做Western blot检测目的蛋白的表达,从而得到能够表达Cap蛋白的单克隆细胞株;选择其中蛋白表达量相对较高的单克隆细胞株,进行一系列的悬浮驯化,然后摇瓶发酵,期间检测细胞的活力和活细胞密度,并取样用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达状况。结果表明:PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中正确表达,且表达的蛋白能够分泌到细胞外;成功驯化表达目的蛋白的单克隆细胞株至悬浮生长;发酵结果显示,发酵过程中活细胞密度可达6×10~6个/ml,细胞活力达80%以上,且目的蛋白的表达产量较高。结论:成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1稳转细胞系,为新型猪圆环病毒疫苗的发展奠定了基础。讨论:目前CHO细胞已经成为生物药物重要的表达和生产系统~[1]。与其他的蛋白表达体系系相比,CHO细胞系具有能够在无血清培养基中悬浮生长,抵抗大多数人类致病病毒的感染,生产的产品安全性高的优点,因此适用于大规模生产,而且CHO属于哺乳动物细胞系,可以进行蛋白翻译后加工修饰~[2],保持蛋白天然的活性和免疫原性。据了解目前还没有利用CHO细胞表达体系来制备预防猪圆环病毒的疫苗出现。本研究率先在CHO-K1细胞表达体系上获得了具有蛋白活性的PCV2-Cap蛋白,为猪圆环病毒亚单位疫苗的制备提供了新思路。

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