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TREM-1基因RNAi慢病毒载体的构建及功能初步检测

宋达疆  黄晓元  任利成  杨兴华  肖目张  王双  
【摘要】:目的:构建TREM-1基因RNAi慢病毒载体,探讨TREM-1在脆弱类杆菌所致炎症反应中的作用。方法:根据小鼠TREM-1的mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,PCR和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TREM-1 mRNA和蛋白表达水平。实时定量PCR、ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。结果:PCR和测序证实目的双链DNA oligo片段已被准确克隆到pGCSIL-GFP载体;各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后都可以显著抑制TREM-1的表达,以第一组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。结论:成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体。证实所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌LPS所诱导的TREM-1的表达。

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