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人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定

谭江琳  袁顺宗  彭旭  马兵  黄正根  程文广  王小娟  甘成军  贾雄飞  王庆红  贺伟峰  胡婕  张小容  胡晓红  罗高兴  吴军  
【摘要】:目的原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白 P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定。方法通过 PCR 方法扩增人 P311基因,利用 BamHI 和 XhoI 酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S -转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体 pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌 BL21(DE3)后,经异丙基硫代-B—D-半乳糖苷(isopropyl—β—D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用 SDS—PAGE、Western blotting 等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的 GST-P311蛋白。结果重组载体 pGEX一4T—P311经酶切与测序鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD 左右,与预期值相符。该条带经免疫印迹检测鉴定为 GST 抗体阳性,获得了纯化的 GST-P311蛋白。结论构建了 pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的 GST 融合蛋白,为下一步继续研究 P311 的生物学功能奠定了基础。

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