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携带RyR2RNAi重组慢病毒载体的构建及小鼠心肌细胞RyR2基因的表达

王前  穆永慧  朱涵  杨春  王志举  章茜  
【摘要】:目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术检测RNAi重组慢病毒对原代培养小鼠心肌细胞中RyR2基因表达的影响,为后续进一步研究RyR2的功能奠定基础。方法:设计合成四对针对小鼠RyR2基因不同位点的短发卡RNA(shorthairpinRNA,shRNA)编码序列,克隆至慢病毒载体psiHIV-EGFP载体,通过测序鉴定寡核苷酸序列。4条重组慢病毒shRNA表达载体分别命名为Lenti-SiRyR2-1~4,在293T细胞中进行病毒包装和滴度测定。重组慢病毒Lenti-SiRyR2感染原代培养小鼠心肌细胞,流式细胞仪检测慢病毒感染细胞的效率,实时荧光定量PCR(real-timequantitative PCR)及免疫印迹(Western Blot)检测慢病毒介导的RNAi对RyR2在mRNA和蛋白水平上的沉默效应。结果:成功构建了针对小鼠RyR2基因4个不同位点的RNAi重组慢病毒表达载体,经PCR和测序鉴定与实验设计合成的RyR2靶基因序列完全一致。在293T细胞中进行病毒包装获得了满足实验要求的病毒滴度。感染原代培养小鼠心肌细胞后,以GAPDH为内参照,real-time PCR结果显示重组慢病毒Lenti-SiRyR2-1~4均可产生较好的干扰效果,以Lenti-SiRyR-2/4效果最佳。采用real-time PCR和Western Blot检测慢病毒介导的靶向RyR2基因沉默效应,结果证实小鼠RyR2表达下调。结论:成功构建靶向RyR2RNAi慢病毒表达载体;RNAi重组慢病毒在原代培养小鼠心肌细胞中感染效率高、基因沉默效果稳定,为后续研究RyR2的基因功能及在心肌细胞生物学行为中的作用奠定了基础。

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