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毕赤酵母表达的木聚糖酶的分离纯化及其性质研究

史宝军  崔细鹏  陈丽芝  吕东海  周镇锋  
【摘要】:正木聚糖酶是可将木聚糖降解为低聚糖和木糖的一类酶的总称,其中,β-1,4-内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)以内切方式作用于木聚糖主链,产生不同链长的寡糖及少量的木糖,是木聚糖降解酶系中最关键的酶。本文探讨了重组毕赤酵母(Pichia pastoris)高密度发酵液中木聚糖酶的分离纯化及其性质研究。试验通过采取盐析、凝胶过滤、超滤及离子交换层析,得到了经SDS-PAGE确认的电泳纯的木聚糖酶。整个纯化过程其酶活回收率为22.4%,纯化倍数为31.8倍。SDS-PAGE法测定蛋白质分子量约为 42kDa,大于理论推算的分子量,表明重组蛋白(木聚糖酶)是糖基化蛋白,该重组木聚糖酶为酸性木聚糖酶。最适pH和对pH的稳定性研究发现,木聚糖酶的最适作用pH为4.5,在pH为3.0~6.0的范围内,木聚糖酶的活性较高,酶活性保持在85%以上,当pH2.0和pH7.0时,木聚糖酶活性下降较大;最适作用温度研究发现,木聚糖酶的最适作用温度为45℃,在35~55℃的温度范围内,酶活性变化不大,当温度超过70℃时,酶活下降较大;木聚糖酶溶液在40℃条件下作用30min后,酶活几乎没有损失,而当该酶溶液作用时间为60min和90min时,木聚糖酶的残留活性为92.1%和85.7%,仅有少量的酶活损失。此外,37℃条件下,用胃蛋白酶、胰蛋白酶处理30min,对酶活无影响。以上均说明该木聚糖酶适用于饲料工业上的实际应用。金属离子和螯合剂对木聚糖酶活性影响的试验显示:(1)Mg2+、 Zn2+、Ca2+对木聚糖酶活性有不同程度的促进作用,而Hg2+、Ag+、 Cu2+、Ba2+、Fe3+等对木聚糖酶有一定的抑制作用,Co2+、K+、 Na+、Fe2+等对木聚糖酶的活性没有明显的作用;(2)EDTA对酶活力没有显著的影响,这说明木聚糖酶反应不需要金属离子的参与。通过对不同木聚糖的酶解产物的糖分分析表明,以桦木木聚糖为底物时,酶解产物主要为木二糖、木三糖和木四糖;以玉米芯木聚糖为底物时, 酶解产物主要为木二糖和木三糖,这证实了该酶为内切β-1-4-木聚糖酶。

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