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家蚕calcyphosphine基因的克隆表达及纯化

葛红秀  解纯刚  张耀洲  
【摘要】:从本实验室构建的家蚕cDNA文库中筛选出一条长1038bp的基因序列calcyphosphine,开放阅读框为720bp,编码239个氨基酸,将其命名为BmCAPS。经生物信息学分析发现该基因含有Ca~(2+)结合位点,具有典型的EF-hand结构域,同时也含有蛋白激酶的磷酸化位点。该蛋白属于钙调蛋白超家族中的一员,可以与钙离子结合,受cAMP调控,在信号传导中起到重要的作用。将BmCAPS插入原核表达载体pET-28a(+)构建重组质粒,经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子的正确后,将该重组子转化大肠杆菌BL21 Star(DE3),经IPTG诱导表达带有His标签的重组融合蛋白。用亲和层析的方法纯化该目的蛋白,经FPLC反相柱层析进一步纯化,再进行质谱鉴定。用纯化的融合蛋白免疫雄性新西兰兔,制备目的蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1:6400以上,Western Blot检测到该抗原具有很好的免疫原性。通过对家蚕五龄幼虫九个组织的WB检测,发现卵巢、睾丸、脂肪体、气管、马氏管等组织中都有表达,其中在睾丸表达量较高,表明这个蛋白与家蚕的生殖发育相关。同时也检测了家蚕五龄幼虫、蛹、蛾、卵发育的四个时期中目的蛋白的表达情况,在五龄幼虫和卵中有明显的特异条带,说明该蛋白在家蚕发育过程中起着重要的作用。同时用Protein A凝胶柱纯化多克隆抗体,纯化所得的抗体可用于后续实验,这为以后研究该蛋白的功能活性打下基础。

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