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凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)几丁质酶家族三个新基因的克隆与组织表达分析

黄乾生  谢晓兰  王烨  魏小倩  陈清西  
【摘要】:几丁质酶是一个多基因家族,广泛存在于各个生物中。果蝇几丁质酶家族包括16个成员,而人类几丁质酶家族有6个成员。几丁质酶主要的功能是降解几丁质,但还参与免疫反应等过程。在甲壳动物中,几丁质酶起着至关重要的生理作用,能帮助甲壳动物完成周期性蜕壳生长,另外还发现其参与对虾抗病毒。但迄今还没有关于甲壳纲几丁质酶家族多基因的报道。本文利用模式生物果蝇(Drosophila melanogaster)中已发现的几丁质酶家族各基因的蛋白编码序列去tblastnNCBI中的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的EST文库。获得若干条EST序列,经过DNAMAN软件拼接,获得两个潜在的对虾几丁质酶新家族成员序列。根据拼接的序列分别设计引物,从凡纳滨对虾肝胰腺中提取总RNA,反转成cDNA,PCR获得产物,结合3-RACE实验,分别得到两条长为1127 bp和1150 bp的部分编码序列,根据已有的研究结果,将其命名为CHT2和CHT6。将该序列提交至NCBIgenebank上,其登录号分别为FJ888479和GQ916594。分析发现CHT2编码分374个氨基酸。Scanprosite分析发现该蛋白含几丁质酶18家族催化保守区(catalytic domain),其中谷氨酸残基(Glu)为活性中心残基。CHT6编码365个氨基酸,也含有谷氨酸活性中心的几丁质酶18家族催化保守区。进一步采用实时PCR技术研究基因在蜕壳间期的对虾不同组织的表达差异,发现CHT2主要在眼柄中表达,相对表达量是β-actin基因的1/3,在腮,壳膜和淋巴细胞中也有微量表达。CHT6在蜕壳间期虾各组织中的表达量都很低,进一步可检测其在蜕壳前期和蜕壳后期的表达变化,以研究其生理功能。

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