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中华蜜蜂核糖体蛋白L17基因(AccRPL17)的克隆及其原核表达

孟飞  刘利  杨海芳  胥保华  郭兴启  
【摘要】:核糖体蛋白L17(ribosomal protein L17,RPL17)是核糖体蛋白基因(ribosomal proteingene,RPG)家族成员之一。RPG突变、缺失或不恰当的化学修饰,不仅影响了核糖体的功能,使多肽合成的活性降低;而且还影响了核糖体蛋白的核糖体外生理功能,从而导致细胞代谢失常、细胞表面抗体减少、细胞生长停滞、死亡等后果。研究表明,RPL17在发育调控,细胞的分裂、增殖、分化等方面发挥着重要作用。但目前对RPL17基因的研究主要集中在哺乳动物中,有关昆虫方面的报道很少。中华蜜蜂是我国的特色蜂种,具有重要的经济价值。本研究以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为材料,利用物种之间的高度同源性,通过RT-PCR及RACE-PCR方法从中华蜜蜂中克隆了一个新的RPL17基因,命名为AccRPL17。基因全序列测定表明,AccRPL17基因cDNA全长640 bp,包括558 bp的开放阅读框(openreading frame,ORF),31 bp的5′非编码区(untranslated region,UTR)和51 bp的3′非编码区。ORF编码一个185个氨基酸的多肽,其分子量大约为21 kD,等电点约为10.78。cDNA序列与基因组序列比较后发现AccRPL17基因组序列含有4个内含子和4个外显子,其中在5′非编码区内存在一个内含子,这属于核糖体蛋白基因家族的一个特征。通过序列比对及系统树分析,AccRPL17氨基酸序列与意大利蜜蜂(Apis mellifera)、茶足柄瘤蚜茧蜂(Lysiphlebus testaceipes)、丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)同源性分别达到98%、97%、97%。以上结果表明,我们克隆到的是RPL17基因。将已获得的AccRPL17 cDNA片段克隆于原核表达载体pET-30a(+)中,并转化大肠杆菌BL21,获得重组质粒pET-30a(+)-AccRPL17。37℃下经IPTG诱导后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)发现该融合蛋白在大肠杆菌BL21中正确表达。将获得的AccRPL17融合蛋白纯化后进行活性鉴定和结构分析。为获得AccRPL17更多蛋白质水平的信息,将融合蛋白收集后免疫小白鼠,得到AccRPL17抗体,对中华蜜蜂进行Western blot分析。核糖体蛋白基因的异常影响核糖体的结构与功能,进而影响蛋白质的合成。核糖体蛋白不仅在发育调控和细胞的分裂、增殖、分化等方面发挥着重要的调节作用,而且研究表明,核糖体蛋白与肿瘤的发生也有着密切联系。这一新基因的获得为进一步研究其在中华蜜蜂中的功能,了解中华蜜蜂中RPG家族各成员之间的相互关系,阐明RPG的表达调控模式提供了重要依据,并对探讨抗肿瘤机制有着重要的实际意义。

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