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中华蜜蜂甲硫氨酸亚砜还原酶A和B基因(AccMsrA,AccMsrB)的克隆及其原核表达

巩志宏  刘利  杨海芳  郭兴启  胥保华  
【摘要】:生物体可通过对蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原来调控蛋白的功能。如甲硫氨酸被氧化而变为甲硫氨酸亚砜,从而可导致所在蛋白的生物学活性降低或丧失。而动物体内普遍存在的甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductases,Msrs)则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸,进而使其所在蛋白质重新恢复活性。甲硫氨酸亚砜还原酶在抗氧化和调控蛋白功能中发挥着重要的作用。甲硫氨酸亚砜还原酶可分为A型(methionine-S-sulfoxidereductase A,MsrA)和B型(methionine-R-sulfoxide reductase B,MsrB),分别还原S型和R型甲硫氨酸亚砜。关于Msrs基因的研究主要集中于哺乳动物与模式昆虫果蝇,而对于蜜蜂中的研究很少。为了探讨蜜蜂中甲硫氨酸亚砜还原酶A和B(MsrA,MsrB)的功能及它们之间的相互作用,了解甲硫氨酸氧化还原的机制,以及明确甲硫氨酸亚砜还原酶在蜜蜂体内的作用,本研究以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为材料,利用同源序列,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法首次从中华蜜蜂中克隆得到MsrA和MsrB基因,分别命名为AccMsrA和AccMsrB。基因序列测定表明AccMsrA基因的cDNA全长为1458 bp,其中包括654 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),103 bp的5′非编码区(untranslated region,UTR)和701 bp的3′UTR。ORF编码一个有217个氨基酸,分子量约为25 kD,等电点为6.78的蛋白。cDNA序列与基因组序列比较后发现AccMsrA有4个内含子和5个外显子。通过序列比对及系统树分析,AccMsrA氨基酸序列与意大利蜜蜂(Apis mellifera)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、威氏果蝇(Drosophila willistoni)的同源性分别达到98%、57%、57%、53%。AccMsrB基因的cDNA全长为756bp,其中包括414 bp的ORF,138 bp的5′UTR和304 bp的3′UTR。ORF编码一个有137个氨基酸,分子量约为15.5kD,等电点为7.77的蛋白。cDNA序列与基因组序列比较后发现AccMsrB有2个内含子和3个外显子。通过序列比对及系统树分析,AccMsrB氨基酸序列与意大利蜜蜂(Apismellifera)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)的同源性分别达到100%、67%、72%、72%。通过比较AccMsrA与AccMsrB的氨基酸序列发现两者之间没有太高的相似性,这与在其它物种中得到的结论相似,可能与它们还原不同构型的甲硫氨酸亚砜有关。以上结果表明,我们克隆得到的是MsrA和MsrB基因。分别以pMD18-T simple和pET-30a(+)为克隆载体和表达载体构建了MsrA和MsrB基因编码区的原核融合表达载体AccMrsA-pET-30a(+)和AccMrsB-pET-30a(+)转化大肠杆菌BL21并对其表达条件进行优化,分别表达出约29 KD和16 KD的融合蛋白,并对重组蛋白进行活性鉴定和结构分析。Msrs广泛存在于生物体各组织,其还原特性在蛋白氧化损伤的修复及机体抗氧化方面发挥重要的作用,本研究克隆得到了AccMsrA和AccMsrB两种基因的cDNA序列,并利用原核表达得到蛋白,这两种新基因及蛋白的获得对于分析蜜蜂中Msrs的结构及生理功能,进一步研究其对动物寿命的影响以及增强对蜜蜂抗氧化体系的理解具有重要的理论和现实意义。

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