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欧洲鳗鲡胃蛋白酶原的分离纯化与酶的性质研究

吴涛  孙乐常  杜翠红  蔡秋凤  张其标  苏文金  曹敏杰  
【摘要】:胃蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族中专门水解蛋白质中疏水性氨基酸残基的肽链内切酶,在鱼体内起着重要的生理和消化功能。在低温下仍然具有高活性的鱼体胃蛋白酶对食品加工、鱼类饵料配制具有重要意义。但是,迄今为止国内外对淡水鱼胃蛋白酶的报道较少。本研究以欧洲鳗鲡为材料,通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel离子交换层析以及Sephacryl S-200、Superdex 75凝胶过滤层析等方法从欧洲鳗鲡胃内纯化得到3种胃蛋白酶原。SDS-PAGE显示纯化得到的3种胃蛋白酶原(PG-Ⅰ,PG-Ⅱ和PG-Ⅲ)和相应的胃蛋白酶(P-Ⅰ,P-Ⅱ和P-Ⅲ)的分子量分别约为36,30;37,30和37,30 kDa。以酸变性牛血红蛋白为底物,3种胃蛋白酶的最适pH分别为3.5,2.5和2.5,最适温度分别为40,40和35℃。这3种胃蛋白酶对酸变性血红蛋白的Km值和kcat分别为:8.8×10-5 mol/L,23.7 s-1;9.2×10-5mol/L,19.4 s-1:7.0×10-5 mol/L和34.4 s-1:kcat/Km依此是2.7×105 mol-1·L·s-1,2.1×105 mol-1·L·s-1和4.9×105 mol-1·L·s-1。用大鼠抗黄鳍鲷PG-Ⅰ,PG-Ⅱ,PG-Ⅲ和PG-Ⅳ多克隆抗体作为一抗,分别对这3种胃蛋白酶原进行Western blot分析,结果显示PG-Ⅱ,PG-Ⅲ均能与4种抗黄鳍鲷多抗发生免疫交叉反应,PG-I只与抗黄鳍鲷PG-Ⅰ,PG-Ⅱ多克隆抗体发生免疫交叉反应。本研究为胃蛋白酶的开发利用提供了理论依据,并为这种极具经济价值鱼类的消化生理研究提供重要的参考价值。

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